Comunicação juncional em macrófago: papel e modulação da junção comunicante no microanbiente da infecção com Toxoplasma gondii

Abstract

Toxoplasma gondii (T. gondii) é o protozoário intracelular obrigatório responsável pela toxoplasmose, e acredita-se que este parasita tenha infectado um terço da população mundial causando grande morbidade e mortalidade.(Mahmoudi et al; 2017) As junções comunicantes são canais transmembrana que permitem a comunicação direta nos tecidos (DHEIN, 1998) e estas junções possuem um papel de destaque em estudos associados às infecções parasitárias.(CAMPOS DE CARVALHO et al, 1998) Os canais juncionais são responsáveis pela troca de íons e pequenos mensageiros que mantém a homeostase tecidual (Adesse, et al., 2011), no entanto, ainda existem sistemas que não estão inteiramente caracterizados a respeito da comunicação juncional. Dentre eles podemos destacar o sistema Imunológico, particularmente os Macrófagos que participam do processo de resposta inata. A caracterização morfológica e funcional das junções comunicantes em macrófagos tem sido alvo de estudo de diversos grupos (Fortes et al., 2004), no entanto seus mecanismos regulatórios ainda merecem esclarecimentos, principalmente diante de alterações patológicas, como nos processos infecto-inflamatórios. Diante disto, o objetivo principal deste estudo é avaliar a modulação estrutural e funcional das junções comunicantes formadas pela Conexina 43 (Cx43) em linhagens macrofágicas tratadas com fatores pró-imune-inflamatórios e após a infecção com o Toxoplasma gondii. A metodologia utilizada foi: (1) Cultura de células de linhagem macrofágica J774-G8; (2) Ensaios imunoeletroforéticos de Western Blot; (4) Ensaios de imunofluorescência e análise por microscopia confocal; e (5) Ensaios de microinjeção intracelular de corantes. As culturas de células foram ativadas com fatores pró-imune inflamatórios (Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) e Interferon-γ (IFN-γ)) ou infectadas com o toxoplasma de cepa RH em sua forma taquizoíta. Os resultados revelaram que as células J774-G8 apresentaram alterações significativas em seu crescimento e perfil de comunicação juncional em experimentos de injeção de corantes, quando submetidas a microambientes com fatores pró-imune inflamatórios combinados (LPS+IFN-γ e IFN-γ + TNF-α) em incubações de até 72 horas. Imagens de imunofluorescência confocal evidenciaram marcação para proteína conexina 43, faloidina (marcador de filamentos de actina) em células de linhagem macrofágica J774-G8, demonstrando uma possível co-localização entre as proteicas Cx43 e actina pela primeira vez em células de linhagem macrófagica. Já as imagens de imunofluorescência confocal marcadas para proteína Cx43, faloidina em células de linhagem macrofágica J774-G8 infectadas com T. gondii, mostraram a significativa diminuição da marcação para faloidina e consequentemente a falta da marcação para Cx43. Os ensaios imunoeletroforeticom evidenciaram o almento da expressão de Cx43 da linhagem celular macrofágica infectadas comparadas ao controle. Concluindo que As células da linhagem macrofágica J774-G8 tratadas com fatores pró-imuno inflamatórios combinados apresentaram alterações no crescimento celular e as células tratadas com fatores combinados apresentaram sua comunicação juncional modulada positivamente. As células da linhagem macrofágica J774-G8 infectadas com o parasita Toxoplasma gondii apresentaram não só alterações no crescimento celular, como também demonstraram alterações morfológicas, acompanhadas de morte celular; A expressão proteica, por transferência imunoeletroforética, da Cx43 se demonstrou alterada (aumentada) em células de linhagem macrofágica J774-G8 infectadas por 24 e 48 horas com o parasita Toxoplasma gondii, quando comparadas com as células não infectadas; As proteínas Cx43 e Faloidina interagem na membrana plasmática de linhagem macrofágica J774-G8 não infectadas com o parasita Toxoplasma gondii, mas sofrem uma sensível redução na membrana após 72 horas de infecção.