Expansão e aprimoramento de ferramenta on-line baseada no uso da técnica de PCR-RFLP para identificação de espécies do gênero Amblyomma Koch, 1844 (Acari: Ixodidae)

Abstract

Durante os últimos 20 anos, pesquisadores brasileiros desempenharam um papel de liderança nos esforços para melhorar o nosso conhecimento da bioecologia, presença de patógenos e dinâmica das populações de carrapatos associados com animais silvestres na América do Sul. Muito destes achados foram fornecidos na forma de dados moleculares, principalmente sequenciamento de marcadores moleculares amplificados usando a técnica da “polymerase chain reaction” (PCR). Pesquisas elaboradas no PPGCV/UFRRJ por nosso grupo, entre 2018-2019, resultaram no desenvolvimento de um sistema robusto e de baixo custo (que serve como uma alternativa ao sequenciamento) para a identificação, em nível de espécie, de carrapatos da família Ixodidae. O sistema é baseado na técnica de PCR-RFLP (do inglês “Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism”), utilizando um fragmento do gene mitocondrial que codifica o RNA ribossômico 16S como alvo. Para facilitar o acesso a esse sistema e promover seu uso por outros pesquisadores brasileiros, foi desenvolvida uma ferramenta “on-line” denominada “TickCutter”. O presente projeto visou expandir e aperfeiçoar esta ferramenta em duas frentes. Em primeiro lugar, uma nova ferramenta denominada “COIsearcher” foi desenvolvida usando um marcador molecular alternativo, especificamente Citocromo C Oxidase I (COI), com o intuito de resolver algumas das limitações associadas com o uso de um único marcador molecular. Em segundo lugar através da inclusão de dados de PCR-RFLP do gene 16S rDNA com as enzimas DraI e VspI, oriundos de espécies de carrapatos da família Argasidae ou provenientes de novos representantes da família Ixodidae. Um total de 35 novos padrões de bandas foram identificados entre 363 sequências inéditas de 16S rDNA procedentes de carrapatos da família Ixodidae. Em relação aos carrapatos da família Argasidae, foram identificados 31 perfis de bandas entre as 75 sequências obtidas do GenBank (os quais representaram 22 espécies de Argasídeos). No entanto, sete padrões procedentes de seis espécies de Argasidae geraram identificações conflitantes com perfis derivados de alguns carrapatos da família Ixodidae. A nova ferramenta “COIsearcher” foi desenvolvida de modo bastante semelhante a ferramenta “TickCutter 16S” e aproveitou de algumas das soluções elaboradas para a resolução de problemas encontrados durante o desenvolvimento do módulo 16S. No entanto, algumas modificações foram necessárias devido as diferenças entre os marcadores, particularmente em termos do tamanho dos “amplicons”. O banco de dados do novo módulo foi estabelecido com base na digestão in silico de “amplicons” virtuais (709 nucleotídeos) do gene COI com as enzimas AluI e MboI, oriundos de espécies de carrapatos da família Ixodidae. Um total de 88 perfis de bandas foram registrados entre as 851 sequências procedentes de 33 das 51 espécies da família Ixodidae. Foram detectadas algumas identificações conflitantes com a ferramenta “COIsearcher”, de modo similar ao notado anteriormente com a ferramenta “TickCutter 16S”. A solução encontrada para resolver estes conflitos foi a identificação de uma terceira enzima capaz de gerar padrões discriminatórios em nível de espécies. As modificações introduzidas na plataforma “TickCutter” fornecerão maior flexibilidade e poder discriminatório ao sistema de identificação atual e oferecerá uma solução para a maioria das limitações associadas ao uso de um único marcador molecular.