Avaliação da população de duas espécies diazotróficas associativas em tecidos de braquiária e milho utilizando PCR quantitativa

Abstract

Bactérias diazotróficas dos gêneros Azospirillum e Herbaspirillum, em associação com gramíneas como o milho e forrageiras do gênero Brachiaria podem promover efeitos benéficos às plantas, como a fixação biológica de nitrogênio (FBN). A técnica de PCR quantitativa (qPCR) é eficiente no monitoramento de populações de bactérias diazotróficas inoculadas, porém sua aplicabilidade em nível de estirpe necessita de maiores estudos. Este trabalho teve o objetivo de selecionar oligonucleotídeos (primers) para posterior quantificação da população de A. brasilense em tecidos de raiz e colmo de braquiária (Brachiaria spp.) e H. seropedicae em raiz de milho (Zea mays) por qPCR. Os primers desenhados foram avaliados quanto a sua especificidade em nível de estirpe e espécie, por meio de PCR convencional. Já a sensibilidade e eficiência dos primers foram determinadas por reações de qPCR. A quantificação por qPCR estirpeespecífica de A. brasilense e H. seropedicae associadas a tecidos de braquiária e milho foi feita a partir de duas curvas-padrão diferentes. Os resultados obtidos por PCR quantitativa com os pares de primer selecionados foram comparados a contagem por microgota. A quantificação da estirpe A. brasilense Sp245 foi feita a partir do DNA extraído de tecidos de colmo e raiz de cultivares de braquiária inoculada e sem inoculação, crescidas em condições de campo. A população bacteriana das estirpes A. brasilense Sp245 e H. Seropedicae ZAE94 foi quantificada através do DNA genômico de raiz de milho inoculado com cada estirpe-alvo e plantas controle, sem inoculação, crescidas em condições de casa de vegetação com substrato estéril sob duas dosagens de N (3 e 0,3 mM). O par de primer Sp245p10, foi específico para a estirpe Sp245 e os pares de primer ZAEF1R1 e ZAEF2R2 foram específicos para a estirpe ZAE94. A quantificação, por qPCR, das estirpes Sp245 e ZAE94 apresentou resultados similares à contagem por microgota. Em relação ao experimento a campo com braquiária, o número de células bacterianas da estirpe Sp245 foi maior em plantas inoculadas das cultivares Basilik e Piatã. No experimento com milho em casa de vegetação, a dose de 3 mM de N favoreceu a população endógena de bactérias da estirpe Sp245 em plantas do tratamento controle, enquanto que a dose de N não interferiu na população das estirpes Sp245 e ZAE94 nas plantas inoculadas