Uso da técnica de PCR em tempo real para quantificação de bactérias Diazotróficas Endofíticas em tecidos de cana-de-açúcar

Abstract

O inoculante para cana-de-açúcar, desenvolvido pela Embrapa Agrobiologia, pode aumentar a produção da cultura por meio da promoção do crescimento vegetal. Esse biofertilizante é composto por estirpes de cinco espécies de bactérias diazotróficas: Herbaspirillum rubrisubalbicans (HCC103), H. seropedicae (HRC54), Gluconacetobacter diazotrophicus (Pal5T), Nitrospirillum amazonense (CbAmc) e Paraburkholderia tropica (Ppe8T), as quais foram isoladas da própria cultura. Além de fixarem nitrogênio atmosférico, essas bactérias também desempenham outros papeis tais como: atividade antipatógena, produção de hormônios vegetais e sideróforos, e o aumento da tolerância a estresses. Apesar desses efeitos benéficos, ainda há necessidade de ampliar o conhecimento sobre o estabelecimento das bactérias inoculadas nos tecidos da cana-de-açúcar. A fim de monitorar a populacional dessas bactérias no interior da planta foram desenhados primers para PCR em Tempo Real utilizando (qPCR) os programas Primers3Plus e Oligo Explore. Esses primers tiveram sua especificidade avaliada em nível de espécie e estirpe utilizando a PCR convencional para posterior utilização na quantificação por qPCR. A quantificação das bactérias do inoculante utilizando o qPCR com os primers selecionados foi comparada com as técnicas de contagem em Câmara de Neubauer e Microgota em placa. Para testar os primers, a partir do DNA extraído de plantas de cana-de-açúcar, foram montados dois experimentos, um ao ar livre em solo e o outro em casa de vegetação em areia com vermicula (2:1) esterilizada, ambos na Embrapa Agrobiologia, Seropédica-RJ, utilizando as variedades de cana-de-açúcar RB867515 e RB92579. As coletas de tecidos ocorreram para o primeiro experimento aos 90, 180 e 270 dias após o plantio e para o segundo aos 25, 40 e 55 dias após a inoculação. O DNA para análise foi extraído de aproximadamente 300 mg de cada tecido (raiz e parte aérea). As análises de PCR mostraram que os primers Hr103C4062, Pt8C14 e Pt8C3641 são provavelmente estirpe-específico para a estirpe HCC103 de H. rubrisubalbicans e a estirpe Ppe8T de P. tropica respectivamente. O primer de maior sensibilidade foi o NaCbCgyrA capaz de amplificar a partir de apenas 0,0000067 ng de DNA alvo. A qPCR mostrou maior sensibilidade para quantificação do número de células bacterianas que a contagem por Microgota em placa pelo teste de média Tukey a 5% de significância. As análises estatísticas do experimento I mostraram que não houve diferença significativa na população geral das bactérias que compõem o inoculante para cana-de-açúcar, para os tratamentos inoculados e não inoculados, ou com e sem dose de N-fertilizante. No experimento II também não houve diferença estatística na média geral, para tratamento inoculado e controle, porém, para as espécies bacterianas do inoculante individualmente houve acréscimo populacional significativo. Além disso, em ambos os experimentos a população das bactérias do inoculante para cana-de-açúcar foi reduzida com o tempo.