Caracterização e especificidade de Rhizobium spp. de leguminosas florestais

Abstract

Foram realizados 2 experimentos em casa de vegetação com leguminosas florestais. O primeiro teve como objetivo observar a ocorrência de nódulos em 43 espécies florestais, pertencentes às 3 subfamílias (Mimosoideae, Faboideae e Caesalpinioideae), em vasos de cerâmica com areia, em blocos ao acaso com 3 tratamentos de inoculação : a) solo do local de procedência da semente; b) grupo 1, de estirpes de Rhizobium isoladas de Piptadenia peregrina (L). Benth. (angico), estirpes: pp-1, Pp-2; Mimosa caesalpiniifolia Benth. (sabiá), estirpes: X-18, X-26; Erythrina speciosa Todaro (mulungú), estirpes: Es-1, Es-3 e Enterolobium ellipticum Benth. (vinhático liso), estirpes: Ee-4, Ee-6; e grupo de estirpes de Rhizobium isoladas de Vigna racemosa (sombreiro), estirpes: Vr-4, Vr-5; Machaerium incorruptibile Allem. (jacarandá), estirpes: Mi-8, Mi-9; Leucaena leucocephala (Lam.) De Wit. (leucena), estirpes: L1-2, L1-10; Albizzia lebbek (L.) Benth. (ébano), estirpes: A1-2, Al-4; Prosopis juliflora (Sw.) DC. (algaroba), estirpes: Pj-1, Pj-2; Lonchocarpus discolor Hub. (catinga de barrão), estirpes: Ld-1, Ld-2; Cassia calycioides DC. (cássia), estirpes: Cc-1, Cc-2 e de Pithecellobium dulce Benth. (pitecelóbio), estirpes: Pd-1, Pd-2. Simultaneamente, foram feitas observações sobre a presença de nódulos em 17 espécies florestais, no campo. A percentagem de nodulação foi assim distribuída: sub-família, Mimosoideae 93%, subfamília Faboideae 78% e subfamília Caesalpinioideae 5%. Observou-se uma relação entre a forma do nódulo e a subfamília, assim é que as espécies da subfamília Mimosoideae apresentam nódulos coralóides, com exceção da espécie Stryphnodendron barbatimão (barbatimão) e as da subfamília Faboideae, nódulos esféricos, independendo da estirpe inoculada. A cor da raiz também é característica da espécie, não havendo relação entre a cor e a presença ou ausência de nódulos. O segundo experimento teve como finalidade observar a inoculação cruzada entre 11 espécies florestais, usadas no 1° experimento e uma espécie forrageira, usada como comparação, inoculadas com 19 estirpes de Rhizobium, em latas de cerveja, com areia, esterilizadas, em blocos ao acaso, com 3 repetições. Algumas espécies mostraram-se altamente, específicas como a sesbânia (Faboideae) e outras altamente promíscuas como, ébano, entada, acácia (Mimosoideae) e mulungú (Faboideae). Quanto às estirpes, algumas mostraram-se específicas como Pd-2 (isolada de pitecelóbio), Am-2 (de acácia), Al-2, Al-4 (de ébano), Es-1 (de mulungú), BR-23 (de estilosante), Pr-1 (de vinhático do campo), e Vr-4 (de sombreiro); outras bem promíscuas como M1-1 (de quebra-foice), Pp-4 (de angico) e outras mostraram especificidade intermediária, como, Am-1, X-26 e X-18, isoladas de acácia e de sabiá, respectivamente. A estirpe que apresentou atividade específica mais alta foi a Pp-4 (com a espécie quebra-foice) com 155,00 n-moles de C2H4/h/mg de nódulos, seguida das estirpes BR-23 (com estilosante), M1-1 (com algaroba), Am-1 (com estilosante), L1-7 (com leucena) e Sm-1 (com mulungli). A estirpe Es-3 foi a que conseguiu maior peso médio de nódulos (101,67 mg, com entada), mas com uma atividade específica muito baixa (5,00 n-moles de C2H4/ h/mg de nódulos). No laboratório, foram realizados 3 ensaios com 54 estirpes de Rhizobium, sendo o 1° em placas de Petri com meio 79 com manitol, riscando-se as placas com a alça de platina, a fim de que as estirpes fossem testadas quanto à pureza e observados a forma, tamanho, aspecto e tempo de aparecimento das colônias. As estirpes, cujo tempo de aparecimento variava de 24 a 72 horas foram consideradas de crescimento rápido, enquanto as que apareciam depois de 72 horas de repicadas, foram consideradas de crescimento lento. As estirpes de crescimento rápido normalmente formaram mais muco do que as de crescimento lento. O aspecto das colônias pouco variou. Algumas eram mais planas, outras um pouco convexas, mas todas apresentaram bordos lisos. Quanto ao tamanho, depois de 48 horas do aparecimento, as colônias variavam de 0,5 a 2 mm de diâmetro, para as estirpes de crescimento lento e de 1 a 4 mm de diâmetro para as de crescimento rápido. O segundo ensaio foi feito em tubos com meio 79 sólido, inclinado, a fim de se observar o uso de 8 fontes de C pelas 54 estirpes e o seu efeito sobre o pH final do meio. O melhor crescimento foi obtido com manitol e o crescimento mínimo com maltose e succinato de sódio. Com exceção das estirpes Ee-1, Ee-3 (isoladas de enterolóbio) que nada cresceram, as restantes tiveram um crescimento ruim a regular nos tubos testemunhas, mostrando que usaram o etanol do indicador (azul de bromotimol) do meio, como fonte de C. O terceiro ensaio, foi também em tubos de ensaio com leite-litmus, em duas repetições, a fim de se observar a reação e a formação, ou não, de zona de soro com as 54 estirpes usadas nos testes anteriores. De acordo com o comportamento nesses ensaios, as estirpes foram divididas em 3 grupos a saber: grupo I, abrangendo as estirpes: M1-1, M1-2, M1-3 (isoladas de Mimosa laticífera), Sm-1, Sm-2 (isoladas de Sesbania marginata), BR-23 (isolada de Stylosanthes), as quais, tiveram um crescimento bom a abundante com galactose, dextrose, arabinose, maltose, manitol, xilose e sacarose, tornaram alcalino o pH final do meio e em leite-litmus alcalinizaram o meio e não formaram zona de soro. O aparecimento das colônias se deu entre 24 e 72 h, porisso, as estirpes foram consideradas de crescimento rápido, com exceção da BR-23 que é de crescimento lento; grupo II, abrangendo as estirpes: Pj-1, Pj-2, Pj-3 (isoladas de Prosopis juliflora), Al-2, Al-3, Al-4 (isoladas de Albizzia lebbek), L1-2, L1-7, L1-10 (isoladas de Leucaena-leucocephala), Pd-1, Pd-2 (isoladas de Pithecellobium dulce), Vr-1, Vr-2, Vr-4 (isoladas de Vigna recemosa), Mi-1, Mi-2, Mi-3 (isoladas de Machaerium incorruptibile), Ld-1, Ld-2, Ld-3 (isoladas de Lonchocarpus discolor), Dm-1, Dm-3 (isoladas de Dimorphandra mollis), Cc-1, Cc-2, Cc-4 (isoladas de (Cassia calycioides), F-310 (isolada de Phaseolus vulgaris), as quais são de crescimento rápido, tornam ácido o pH final do meio com todas as fontes de C, com exceção do meio com succinato. As estirpes desse grupo se desenvolveram melhor em galactose, dextrose, manitol e xilose. Em leite-litmus, a maioria das estirpes acidificou o meio e formou uma zona de soro. Uma das exceções foram as estirpes Pd-1, Pd-2 que apresentaram reação alcalina, mas formaram zona de soro. O aparecimento das colônias se deu entre 24 e 72 h. e grupo III, abrangendo as estirpes: Pp-2, Pp-3, Pp-4, Pp-7 (isoladas de Pintadenia peregrina), Ep-1, Ep-2, Ep-3 (isoladas de Entada polyphylla), Ee-1, Fe-2, Ee-3 (isoladas de Enterolobium ellipticum), X-13, X-18, X-26 (isoladas de Mimosa caesalpiniifolia), Am-1, Am-2, Am-3 (isoladas de Acacia mollissima), Pr-1, Pr-2, Pr-3 (isoladas de Plathymenia reticulata), Es-1, Es-2, Es-3 (isoladas de Erythrina speciosa), divididas em subgrupos a saber: o primeiro subgrupo, com as estirpes de crescimento rápido, as quais acidificam o meio com galactose, dextrose, arabinose e xilose e o alcalinizam com maltose, manitol, succinato e sacarose e o segundo subgrupo, incluindo estirpes de crescimento lento, as quais tiveram um comportamento idêntico ao primeiro subgrupo com todas as fontes de C. Desses 3 grupos, foram escolhidas 10 estirpes, a fim de se examinar a forma dos flagelos, tentando-se, assim, observar as afinidades entre as estirpes. Com exceção da estirpe X13 (de sabiá) que apresentou flagelação lofotríquia, as restantes, tanto as de crescimento rápido: Pp-2, Mi-1, Sm-1, L1-7, Al-2 (isoladas de angico, jacarandá, sesbânia, leucena e ébano, respectivamente), como as de crescimento lento: Ep-2 e Pr-3 (isoladas de entada e de platimênia) apresentaram flagelação monotríquia. Duas estirpes M1-1 (isolada de quebra-foice) e BR-23 (de estilosante) não flagelaram.