Levantamento molecular de Mycobacterium Leprae e Rickettsia spp. em Amblyomma spp. associados a tatus (euphractus sexcinctus e priodontes maximus) no Brasil

Abstract

A descoberta da transmissão zoonótica do Mycobacterium leprae por tatus-galinha (Dasypus novemcinctus) nos Estados Unidos da América (EUA) desafiou as perspectivas de erradicação da lepra, e as evidências estão se acumulando para apoiar um papel semelhante para os tatus brasileiros, incluindo D. novemcinctus e o tatu peba (Euphractus sexcinctus). Associações entre carrapatos do gênero Amblyomma e diversas espécies de tatu foram registradas no Brasil. Porém, poucos estudos investigaram a possível infecção de carrapatos associados a tatus por bactérias do gênero Rickettsia e nenhum avaliou a presença de M. leprae. A justificativa para realizar tais investigações é fornecida por dados recentes que implicam Rickettsia amblyommatis, infectando Amblyomma pseudoconcolor (recuperado de E. sexcinctus), como o provável agente etiológico de um surto de febre maculosa em Pernambuco (PE), e pela observação de que, após infecção de fêmeas adultas de carrapatos Amblyomma sculptum por meio de alimentação artificial, as células de M. leprae persistiram no intestino médio e puderam ser detectadas nos ovários dos carrapatos. Além disso, as bactérias foram detectadas na progênie (ovos e larvas), sugerindo um papel dos carrapatos como reservatórios e/ou vetores do M. leprae. O presente projeto examinou 30 carrapatos recuperados de espécimes de E. sexcinctus, sabidamente infectados por M. leprae, coletados no Rio Grande do Norte (RN) e mais 44 carrapatos coletados de tatus gigantes (Priodontes maximus), no Mato Grosso do Sul. Sul (MS). Os carrapatos do RN foram identificados como Amblyomma auricularium (14 ninfas e 16 adultos), com base no sequenciamento do 16S rDNA e caracteres morfológicos, e amostras do MS foram identificadas como Amblyomma sculptum (41 adultos e 3 ninfas). O DNA foi extraído de carrapatos por homogeneização usando um aparelho “bead-beater”, seguido de purificação com fenol e clorofórmio. O DNA foi examinado em uma bateria de ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR), projetada para amplificar sequências de DNA de carrapatos (16S rDNA, COI e ITS2) e sequências presentes em Rickettsia (htrA, ompA, ompB, sca1, sca2, sca9, sca14, atpA e coxA). Além disso, dois ensaios utilizaram a sequência RLEP do M. leprae como alvo. Nenhuma evidência foi encontrada da presença de DNA de M. leprae em nenhum dos 74 carrapatos examinados. Da mesma forma, não houve evidência da presença de DNA de Rickettsia nos carrapatos A. sculptum (n=44). Em contraste, 24/30 A. auricularium foram infectados com pelo menos uma espécie de Rickettsia com base em dados gerados por polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição de PCR (PCR-RFLP) e confirmados por sequenciamento de nucleotídeos. Um total de 13 (44,3%) amostras foram classificadas como coinfectadas com R. amblyommatis e R. belli, e um único carrapato (3,33%) foi designado como coinfectado com Rickettsia parkeri (baseado apenas em PCR-RFLP dados) e R. bellii. Oito carrapatos (26,6%) foram infectados somente com R. bellii e as duas amostras restantes foram classificadas como infectadas com R. amblyomattis. A análise da sequência dos “amplicons” ompA mostrou que as cepas de R. amblyommatis eram idênticas entre si e a análise BLASTn mostrou que elas tinham 100% de similaridade de nucleotídeos com sequências ompA derivadas de cepas de R. amblyommatis identificadas em carrapatos A. auricularium e A. pseudoconcolor recuperado de espécimes de E. sexcinctus em Pernambuco. A ausência de níveis detectáveis de DNA de M. leprae, em A. auricularium recuperado de espécimes de E. sexcinctus naturalmente infectados com o patógeno, indicou que a transmissão de M. leprae a humanos através de carrapatos é improvável. A detecção de A. auricularium infectado com R. amblyommatis e R. bellii confirma observações anteriores. Entretanto, a detecção de espécimes coinfectados foi inédita para esta espécie de carrapato. Os sistemas PCR-RFLP utilizados forneceram uma abordagem alternativa, rápida e econômica (em relação às estratégias baseadas em sequenciamento ou PCR em tempo real) para avaliar coinfecções, um fenômeno potencialmente significativo que provavelmente permanece subestimado.