O papel de inibidores de NADPH oxidases sobre as atividades da ferro redutase de Leishmania amazonensis (LFR1) e sua possível pnfluência na diferenciação e infectividade do parasito

Abstract

A espécie Leishmania amazonensis ocorre em várias partes do Brasil e é o agente causador das leishmanioses cutâneas, transmitidas por insetos vetores flebotomíneos para hospedeiros vertebrados. Durante o ciclo de vida do parasito, há uma alternância entre as formas promastigotas, presentes no vetor, e as formas amastigotas infectivas intracelulares, que surgem da diferenciação dos promastigotas metacíclicos no hospedeiro mamífero. Recentemente, foi descrito que a enzima ferro redutase (LFR1) de L. amazonensis, quando ativada por heme, também pode atuar como uma NADPH oxidase (NOX). Esta enzima bifuncional parece estar envolvida no processo de diferenciação do parasito e pode constituir um novo alvo farmacológico. As NOXs estão envolvidas em várias patologias como câncer, doenças cardíacas e neurodegenerativas e, portanto, há uma busca intensa por fármacos que inibam a atividade dessas enzimas. Alguns desses inibidores estão disponíveis comercialmente, como o Setanaxib, GKT136901 e VAS2870. Nesse contexto, a fim de investigar o funcionamento da LFR1 como alvo para a terapia medicamentosa contra as leishmanioses, este estudo avaliou o efeito desses inibidores nas atividades da LFR1 de L. amazonensis e verificou seus efeitos na proliferação, diferenciação e infectividade dos parasitos. Além disso, o foi conduzida uma análise in silico, que avaliou o possível sítio de interação desses compostos na LFR1. Resultados preliminares usando o reagente Amplex Red® para medir a produção de H2O2 heme-dependente mostraram o Setanaxib a 15 µM, GKT136901 a 2,5 µM e o VAS2870 em concentrações tão baixas quanto 1 µM foram capazes de abolir totalmente a atividade NOX da LFR1. O efeito citotóxico desses inibidores contra formas promastigotas também foi avaliado através do teste MTT, em que somente o VAS2870 exibiu efeito tóxico, mostrando perda de 25% e 90% da viabilidade celular na presença de 10 µM do inibidor, após 24h e 72h, respectivamente. Na atividade ferro-redutásica da LFR1, medida através de método colorimétrico com o reagente K3Fe(CN)6, o promissor inibidor VAS2870 a 1 µM não mostrou efeito inibitório significativo, porém inibiu essa atividade em concentrações acima de 5 µM. A análise in silico, que visou demonstrar a possível interação entre o VAS2870 com o domínio desidrogenase da LFR1, cuja estrutura foi modelada ab initio, mostrou que esse inibidor interage covalentemente com o sítio ativo da enzima de forma estável. Em culturas axênicas que estimulam a diferenciação de promastigotas para amastigotas, o VAS2870 parece atuar inibindo esse processo em concentrações não-citotóxicas, embora não tenha exercido efeito sob a infecção de L. amazonensis em macrófagos murinos. Esses resultados sugerem que o VAS2870 pode atuar em ambas as atividades da LFR1, exercendo efeitos no ciclo de vida de L. amazonensis. Diante disso, não é descartada a necessidade de estudos mais profundos a respeito dos efeitos desses e de outros inibidores NOX na LFR1.