Caracterização de receptores Toll-like relacionados à resposta imune no carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Abstract

Os receptores Toll-like (TLR) são proteínas transmembranares altamente conservadas que desempenham papel importante no reconhecimento de patógenos. Este estudo visa identificar a possível presença e expressão diferencial de receptores Toll-like em tecidos e células importantes para a resposta imune inata do carrapato R. (B.) microplus. Para tal, identificamos genes de R. (B.) microplus que codificam homólogos de receptores Toll, denominados RmToll-like e RmToll8-like. Detectamos a presença desses receptores nos principais órgãos envolvidos na resposta imune, corpo gorduroso, hemócitos, glândula salivar e célula digestiva. A expressão gênica dos receptores Toll-like, avaliada por qPCR, mostrou modulação nos diferentes tecidos analisados, e confirmamos a expressão desses receptores pelas técnicas de Western Blot e microscopia confocal. Como o corpo gorduroso representa um importante órgão de defesa imune e apresentou uma maior modulação dos receptores estudados nós optamos por investigar mais profundamente esses receptores neste tecido. No corpo gorduroso, esses receptores foram encontrados especificamente nos trofócitos arredondados, em suas membranas celulares e vesículas intracelulares. A expressão gênica dos receptores Toll-like foi avaliada por qPCR 6, 24 e 48 horas após os desafios com o fungo entomopátogenico Beauveria bassiana. A transcrição de RmToll-like foi modulada positivamente 48 horas após o desafio com B. bassiana, mas não observamos modulação do gene RmToll8-like nos diferentes tratamentos e em função dos tempos de exposição ao fungo. Entretanto, ao avaliarmos a expressão das proteínas desses receptores dos carrapatos desafiados com o fungo, não observamos diferença entre os tratamentos e nos tempos analisados. Quando investigamos uma cepa menos virulenta do fungo observamos que RmToll-like foi modulada positivamente nos tempos de 24h e 48h, sendo esta modulação menor quando comparada com a modulação pela cepa mais virulenta. Em relação ao RmToll8-like não observamos diferença entre os tratamentos e nos tempos analisados. A expressão dos genes de peptideos antimicrobianos também foi modulada pelo desafio com fungo, contudo indicando uma possível imunosupressão, mas investigações futuras com novos tempos de desafio devem ser consideradas. Avaliando o efeitos de uma molécula padrão de superfície de patógenos, o zimosan, observamos um aumento significativo na expressão do RmToll-like, mas não em relação ao RmToll8-like. Avaliamos a expressão das proteínas dos receptores em carrapatos desafiados com zimosan, não observamos diferença entre os tratamentos e nos tempos analisados. O presente trabalho mostra pela primeira vez a presença de receptores Toll-like em carrapatos, e relata a expressão diferencial entre diferentes tecidos engajados na resposta imune inata e modulação por desafios imunológicos neste artrópode.