O líquido apoplástico de cana-de-açúcar modula o perfil transcriptômico global da bactéria diazotrófica Burkholderia tropica in vitro

Abstract

Algumas bactérias diazotróficas colonizam preferencialmente os tecidos vegetais internos e dentre elas destaca-se a Burkholderia tropica que possui baixa sobrevivência no solo. Existem relatos que bactérias diazotróficas endofíticas localizam-se no apoplasto de cana-de-açúcar, um nicho ecológico que apresenta características peculiares que possibilitam sua colonização por bactérias tais como: redução de competição por nutrientes, proteção contra excesso de oxigênio, fonte de carboidratos, aminoácidos, íons orgânicos e outras. Porém, os mecanismos da interação planta - fluido apoplástico ainda não são bem elucidados sendo a transcriptômica uma ferramenta que pode auxiliar no conhecimento desse fenômemo. Neste sentido, foi realizado um experimento comparando-se o crescimento da bactéria em três condições distintas: meio JMV completo (MM), meio JMV diluído com 50% de água destilada estéril (MA) e meio JMV com 50% de fluido do apoplasto (MLA) - extraído de plantas de cana-de-açúcar da variedade RB867515. O RNA total foi extraído, os rRNAs foram removidos, os mRNAs enriquecidos e bibliotecas de cDNA construídas com sequenciamento em sequenciador Ion Torrent em parceria com a UFPR. Os resultados dos sequenciamentos foram analisados com o programa CLC. Os resultados mostraram 503 genes reprimidos e 157 genes induzidos na presença do fluido do apoplasto (MLA) em comparação ao meio completo (MM) enquanto que 703 e 387 genes foram reprimidos e induzidos, respectivamente, na presença do fluido do apoplasto em comparação ao meio diluído (MA). Esses genes diferencialmente expressos pertencem a diferentes classes. Genes relacionados à quimiotaxia e ao movimento foram reprimidos na presença do fluido do apoplasto indicando que a bactéria não se movimenta ativamente. A expressão de genes que poderiam ativar respostas de defesa na planta foi reprimida em Ppe8 na presença do fluido do apoplasto, dentre eles estão os genes envolvidos na biossíntese de lipopolissacarídeos (LPS), exopolissacarídeos (EPS) e peptídeoglicano, além de flagelos também envolvidos em quimiotaxia, conforme discutido acima. Houve expressão diferencial de genes envolvidos com o metabolismo de carboidratos, aminoácidos, íons orgânicos, lipídeos e produção e conversão de energia dentre outras classes, indicando que o metabolismo de Ppe8 é ativo na presença do fluido do apoplasto. Com o objetivo de selecionar genes normalizadores para validar as análises de transcriptômica, a estirpe Ppe8 foi cultivada em meio JMV com cinco fontes de carbono distintas (ácido aconítico, glicose, frutose, sacarose, manitol) e o caldo de cana. As análises realizadas com os programas GeNorm e NormFinder indicaram os genes lpxC, gyrB e recA como os genes de referência mais estáveis. A robustez dos dados obtidos nos estudos de RNA-seq foi confirmada através da análise de expressão de sete genes selecionados aleatoriamente (bceE, fliP1, icmF1, nifE, paaF, secD e tsf) por RT-qPCR, usando-se os genes lpxC e recA, previamente testados, como genes de referência. Os resultados deste estudo sugerem que a estirpe Ppe8 de B. tropica altera a expressão de genes na presença do líquido do apoplasto principalmente para fazer uso dos compostos presentes no fluido do apoplasto, bem como evitar a indução dos mecanismos de defesa da planta. Este é um estudo pioneiro de compreensão da expressão molecular de genes na estirpe Ppe8 cultivada em presença de compostos de plantas de cana-de-açúcar.