Produção de anticorpos IgY de galinhas e IgG de coelhos para análise de auxina e citocininas

Abstract

A determinação do nível hormonal endógeno pode ser uma excelente ferramenta para estudar o desenvolvimento vegetal. Atualmente, fica limitada devido a complexidade das metodologias adotadas, uma vez que demandam equipamentos e reagentes de alto custo e ainda apresentam baixo rendimento. Por outro lado, os ensaios imunoenzimáticos possuem algumas vantagens que superam essas limitações, demonstrando um potencial de uso prático na dosagem de hormônios vegetais. Entre os ensaios imunoenzimáticos, destaca-se o teste Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), o qual vem sendo utilizado na detecção de moléculas com baixo peso molecular. No entanto, o teste ELISA exige anticorpos específicos e que sejam capazes de reconhecer as moléculas de interesse, no caso os hormônios vegetais. Hoje no mercado não há anticorpos disponíveis para a determinação das moléculas hormonais. Diante disso, propôs-se produzir e caracterizar anticorpos contra moléculas de AIA, 2ip e zeatina e posteriormente, usá-los na detecção dessas moléculas. Para isso, as moléculas hormonais foram conjugadas com proteína (BSA) para posterior imunização de galinhas poedeiras ou coelhos. A partir do soro de coelhos ou de gemas de ovos de galinhas os anticorpos foram purificados e caracterizados através do teste de imunodifusão, SDSPAGE e teste ELISA. Os anticorpos que apresentaram melhores resultados foram utilizados na detecção de moléculas hormonais em amostras de tecidos de plântulas mantidas in vitro. O teste de imunodifusão revelou que os anticorpos obtidos foram capazes de detectarem a molécula em estudo. Através do SDS-PAGE verificou-se que os anticorpos obtidos em gemas de ovos de galinhas apresentaram maior pureza que os obtidos em coelhos, sugerindo que os mesmos possuem maior potencial de uso prático. A partir dos resultados do teste ELISA, observou-se que os anticorpos contra AIA não apresentaram potencial de uso prático na determinação dessa molécula em amostras vegetais. Sendo assim, a detecção de moléculas hormonais em amostras de tecidos vegetais ficou restrita a 2ip e a zeatina. A detecção dessas duas moléculas em extrato bruto, obtidos a partir de plântulas de gérbera mantidas in vitro, revelou que o nível endógeno de zeatina foi superior ao nível de 2ip. Plântulas com seis semanas após a repicagem apresentaram maior nível de zeatina do que plântulas recém repicadas, enquanto para o 2ip, essa diferença não foi evidente. O uso de anticorpos obtidos em gemas de ovos de galinhas permitiu a detecção e quantificação de zeatina e 2ip em amostras vegetais utilizando o teste ELISA.