Caracterização de transportadores envolvidos na remobilização de nitrato armazenado no vacúolo em arroz

Abstract

O acúmulo de nitrato (NO3-) nos vacúolos celulares é uma estratégia de extrema importância para suprir o nitrogênio (N) necessário ao desenvolvimento da planta devido as variações de disponibilidade no solo. O transporte desse íon pelo tonoplasto é mediado por proteínas transportadoras específicas, ainda pouco conhecidas. A identificação dessas proteínas permite esclarecer o processo de acúmulo e remobilização de NO3- e delinear estratégias visando aumentar a eficiência do uso de N. O objetivo deste trabalho foi a identificação de genes que codificam proteínas transportadoras responsáveis pela remobilização do NO3- acumulado no vacúolo em arroz. Inicialmente sequências de aminoácidos potencialmente codificantes de proteínas de transporte de NO3- expressas no vacúolo foram reunidas e realizada uma análise filogenética. Em seguida avaliou-se a resposta de expressão destas proteínas frente ao flush de NO3- em um experimento com plantas de arroz (var. Manteiga) em solução nutritiva de Hoagland com 5 mM de N-NO3- por 30 dias, sob um período de supressão de N por 72 horas, seguido do ressuprimento do fornecimento de N. Posteriormente, os genes OsNPF7.8 e OsNPF5.13 foram clonados inseridos em vetor de superexpressão e realizou-se a transformação genética de plantas de arroz (var. Nipponbare) via A. tumefaciens. Dois experimentos foram realizados semelhantes ao inicial com modificação no tempo de cultivo e nas coletas: as linhagens OsNPF7.8 foram cultivadas em dose constante por 20 dias e submetidas a 72h de supressão seguido pelo ressuprimento do fornecimento de NO3- realizando coletas após a supressão e 24h após o ressuprimento. As linhagens OsNPF5.13 foram cultivadas em dose constante por 24 dias e submetidas a supressão de N realizando coletas 24 e 96 h após a supressão. Um total de 71 genes foram utilizados na criação da árvore filogenética que evidenciou a diferenciação entre as sequências codificantes de canais de cloreto (CLC), transportadores de alta afinidade (NRT2) e de baixa afinidade (NPF) com a separação de 8 grupos. Dentre os transportadores de baixa afinidade o grupo III reuniu genes da família NPF5 caracterizadas como atuantes no efluxo de NO3- a partir do vacúolo em A. thaliana, e o grupo IV genes NPF7 com genes caracterizados como atuantes no influxo de NO3- para o vacúolo em arroz. A análise de expressão demonstrou que os genes OsNPF5.12, OsNPF5.13, OsNPF5.15, OsNPF5.16sp1 e OsNF5.17 apresentaram indução de transcrição em resposta a supressão do fornecimento de NO3- na solução associado ao aumento dos teores de NO3- na planta e da atividade da enzima nitrato redutase (NR), indicando relação com o efluxo de nitrato a partir do vacúolo. Por outro lado, o gene OsNPF7.8 apresentou maior resposta ao período de ressuprimento relacionando-o ao influxo do íon. A superexpressão do gene OsNPF5.13 resultou em maior atividade da NR, aumento dos teores de amônio, N-amino e açucares solúveis demonstrando um aumento da estabilidade da assimilação de N. Enquanto as linhagens superexpressando o gene OsNPF7.8 apresentaram aumento dos teores de NO3- na raiz e da atividade da NR, além de aumento dos teores de amônio e N-amino nas folhas, demonstrando alterações no influxo de NO3- nas raízes.