Caracterização bioquímica de proteases digestivas em larvas de Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae)

Abstract

O Alphitobius diaperinus é considerado uma praga importante em ambiente aviário. O estudo do seu comportamento, hábitos alimentares e enzimas digestivas, podem indicar alvos importantes no seu controle. O controle do A. diaperinus é considerado difícil, seus inimigos naturais são pouco conhecidos e sendo o uso de inseticidas químico o principal método de controle. Proteases digestivas de insetos catalisam a produção de peptídeos e aminoácidos a partir de uma dieta protéica e são encontradas na região do intestino médio dos insetos. As atividades proteolíticas no trato digestivo das larvas e adultos de A. diperinus foram determinadas utilizando azocaseína e substratos especificos após alimentarem-se de diferentes dietas. O extrato bruto do homogeneizado do trato digestivo das larvas A. diaperinus mostrou atividade sobre azocaseína e Abz-Phe-Arg-MCA e foi inibida em mais de 50% pelo inibidor da cisteíno protease E-64 e foi ativado por DTT 2,0 mM em pH ácido. Nove bandas foram detectadas com atividade proteolítica e massa molecular na faixa 10 kDa – 100 kDa através de zimograma, utilizando gelatina 0,1% como substrato. Diferentes classes de proteases foram identificadas na presença de inibidores de proteases clássicos como E-64, iodoacetamida e ácido iodoacético, PMSF, SBTI, aprotinina e TLCK. Foi observado maior nível de atividade proteolítica em pHs entre 5 e 6. Embora tenham sido observadas combinações de proteases de serina e cisteína, as proteases ácidas apresentaram níveis mais altos de atividade proteolítica. O cálcio aumentou a atividade proteasica em concentrações maiores que 2,0 mM. Análises de nano-HPLC bidimensional e ESI-MS/MS resultaram na identificação de proteases como tripsina, catepsinas, metaloproteases, aminopeptidases, peptidases e dipeptidases. Foi observado alto potencial inibitório de diferentes séries de imidazolonas sobre atividade cisteíno proteases, a qual pode ser utilizada como ferramentas de controle do A. diaperinus.