Estudo morfo-fisiológico de hemócitos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus infectadas por Metarhizium spp. marcado com GFP

Abstract

Metarhizium spp. é um fungo amplamente utilizado no controle biológico de artrópodes. Os hemócitos, as células presentes no hemolinfa, estão envolvidos na resposta imune destes ectoparasitas, principalmente quando desafiados por patógenos. A obtenção dessas células é dificultosa e muito pouco se conhece sobre a morfologia dos hemócitos de Rhipicephalus microplus e sua resposta às infecções. O presente estudo teve como objetivos o estabelescimento de um melhor protocolo para a obtenção de hemócitos de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus e a análise morfológica dessas células em condições fisiológicas e quando infectadas por fungos artropodopatogênicos marcados ou não com GFP. Foram testados diferentes velocidades de centrifugação da hemolinfa, e o método com maior viabilidade celular e alta concentração de células foi aplicado após a inoculação fúngica em fêmeas ingurgitadas de R. microplus. Após a exposição por imersão, os parâmetros das fêmea ingurgitadas avaliados foram o peso da massa de ovos, índice de produção de ovos, período de incubação das larvas, índice nutricional e o percentual de controle. Posteriormente, a coleta de hemolinfa foi realizada e os hemócitos foram separados do plasma, ressuspensos em PBS e quantificados na câmara de Neubauer. Além da quantificação, os hemócitos foram submetidos às colorações de hematoxilina e eosina e PAS, além de serem submetidos à microscopia eletrônica de transmissão. Para a padronização, a centrifugação em 500 × g durante três min a 4 ° C foi considerada mais eficiente, e foi aplicada após inoculação de fungos. Posteriormente, no bioensaio por imersão, os resultados dos dois isolados fúngicos foram muito parecidos entre si, demonstrando que a marcação molecular não influenciou na virulência dos fungos. No entanto, para a quantificação de hemócitos, a inoculação foi utilizada e todos os isolados foram capazes de diminuir a concentração em aproximadamente 80% em comparação com a quantidade de hemócitos de fêmeas não infectadas. Em condições fisiológicas foram identificados cinco tipos de hemócitos (pró-hemócitos, granulócitos, esferulócitos, plasmatócitos e oenocitóides) e quando as fêmeas foram infectadas com Metarhizium, estas células apresentavam em processo de morte celular e algumas células também possuiam a internalização do fungo em questão, sugerindo a presença de um processo de fagocitose. Desta forma, sugere-se que a infecção por fungos entomopatogênicos pode gerar alterações nos hemócitos de R. microplus e influenciar diretamente na concentração dessas células. Este trabalho foi o primeiro a realizar microscopia eletrônica de transmissão em hemócitos desta espécie de carrapato e foi o primeiro a descrever alterações celulares decorrentes de infecção fúngica através de microscopia eletrônica de transmissão.