Análise proteômica comparativa em Gluconacetobacter diazotrophicus estirpe PAL5 em resposta a presença de peróxido de hidrogênio e efeitos do estresse na colonização de plantas de arroz

Abstract

O nitrogênio é um nutriente absorvido em maiores quantidades pelas plantas e, apesar de ser abundante na atmosfera, encontra-se em uma forma não-assimilável. Entre as alternativas de entrada de N para os ecossistemas, fixação biológica de nitrogênio (FBN) é considerada como a mais viável, uma vez que reduz os custos e danos ao meio ambiente, diminui a dependência de fertilizantes nitrogenados e contribui para a fertilidade do solo. Este processo é realizado pela enzima nitrogenase e requer grandes quantidades de ATP fornecidos pela respiração aeróbica. Durante este processo, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser geradas, danificando as células, inibindo a atividade da nitrogenase e afetando os processos de fotossíntese e colonização. Para conseguir realizar a FBN e colonizar plantas, as bactérias endofíticas devem resistir de forma eficiente ou reparar os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio. Gluconacetobacter diazotrophicus é uma bactéria diazotrófica endofítica que, quando submetida a estresse oxidativo, expressa proteínas que eliminam diretamente os oxidantes. Neste estudo, foi analisado o efeito do estresse oxidativo induzido pelo H2O2 no perfil de expressão de proteínas e na colonização de G. diazotrophicus estirpe PAL5 em plantas de arroz. Para tal, a estirpe selvagem de G. diazotrophicus foi cultivada em triplicata biológica em meio LGI-P modificado, seguido da exposição das células ao tratamento com a presença e a ausência de H2O2 (tratamento controle). As células foram coletadas em diferentes intervalos de tempo após a indução ou não com o H2O2, foram realizadas coletas de 15, 30 e 60 minutos. A partir destes cultivos foram obtidas as proteínas totais de cada tratamento as quais foram analisadas por meio de proteômica quantitativa label-free. Na análise de espectrometria de massa foram identificadas proteínas em vários processos celulares como replicação, transcrição, divisão celular, proteólise, processos biossintéticos, transporte, entre outros. As proteínas envolvidas na defesa celular contra o estresse oxidativo foram identificadas após 30 minutos de exposição ao H2O2, com aumento da abundância de Peroxidase e Superóxido Dismutase. Além dessas proteínas, várias outras proteínas relacionadas aos processos de oxidação-redução também foram observadas com maior abundância diferencial. Em adição foi realizado um estudo visando verificar se o estresse oxidativo induzido por H2O2 afeta a colonização da estirpe PAL5 quando inoculada em plantas de arroz. Para tal, foi realizado o cultivo das plantas de arroz variedade IAC4440, inoculadas ou não com a estirpe PAL5 contendo o gene repórter mcherry inserido no plasmídeo pMP7604. As raízes foram coletadas e visualizadas em microscópio confocal, maceradas e plaqueadas em placas de meio LGI-P modificado para contagem das unidades formadoras de colônia (UFC). Os resultados obtidos neste ensaio mostram que o estresse oxidativo induzido por H2O2 não afetou a colonização desta bactéria nas plantas de arroz já que não houve diferença no número de UFC entre os diferentes tratamentos e a análise microscópica mostrou que a colonização endofítica das raízes pela estirpe PAL5 não foi alterada pelo estresse oxidativo. Os resultados da análise proteômica associada aos estudos de colonização sugerem que a bactéria PAL5 aciona mecanismos de proteção ao estresse oxidativo visando diminuir rapidamente os níveis de espécies reativas de oxigênio para que estes não afetem seu desenvolvimento e colonização endofítica.