Efeito da inibição da fosfolipase C pelo U73122 sobre o sêmen ovino

Abstract

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do U73122 sobre a congelabilidade do sêmen ovino, uma vez que este reagente pode evitar a capacitação prematura e reação acrossomal induzidas durante o processo de criopreservação. Para isso, ejaculados de quatro carneiros da raça Santa Inês foram obtidos com auxílio de vagina artificial. No ensaio I, espermatozoides de quatro ejaculados, in natura, foram submetidos à incubação de 4h a 37°C, suplementados ou não com as concentrações de 10, 20 ou 30μM do U73122, na presença ou ausência do glicerol. Parâmetros cinéticos foram avaliados ao decorrer da incubação, a fim de verificar o comportamento dos espermatozoides pelo uso do reagente, e selecionar doses a serem utilizadas durante a criopreservação. Dezesseis ejaculados foram utilizados no ensaio II, os quais foram criopreservados com diluentes Botubov® fração única, acrescidos ou não do reagente U73122 nas concentrações de 10 e 20μM. As amostras descongeladas foram avaliadas quanto à cinética espermática, pelo sistema “Computer Assisted Sperm Analysis” (CASA), e quanto à integridade de membranas pela associação de sondas fluorescentes iodeto de propídeo, PSA-FITC e JC-1. Adicionalmente, foram realizadas avaliações da capacitação espermática e reação acrossomal com o uso da sonda fluorescente hidrocloreto de clortetraciclina (CTC) antes e após as amostras de sêmen criopreservadas serem submetidas à indução da capacitação in vitro durante 4h de incubação a 37°C. Todos os resultados foram submetidos à análise de variância e ao teste de diferença mínima significativa (DMS) de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. O tratamento dos espermatozoides in natura com diferentes concentrações do U73122, durante incubação de 4h a 37°C, revelou um efeito dose e tempo-dependente sobre a utilização deste reagente em espermatozoides. Além disso, a presença do glicerol potencializou o efeito tóxico do U73122 sobre as células. Nos espermatozoides criopreservados, o U73122 não afetou nenhum dos parâmetros cinéticos avaliados pelo sistema CASA, nem o número dos espermatozoides com as membranas plasmáticas, acrossomais e mitocondriais íntegras (PIAIC) ou lesadas (PLALS). As avaliações realizadas imediatamente após o descongelamento mostraram que a utilização de 10 ou 20μM do inibidor reduziu o percentual de espermatozoides capacitados e com acrossoma reagido em relação ao grupo controle (p<0,05). Após a indução da capacitação in vitro, houve uma redução (p<0,05) do número de espermatozoides não capacitados em todos os tratamentos sugerindo um efeito reversível do U73122 sobre os processos de capacitação espermática e reação acrossomal. Conclui-se que o uso de 10 μM do reagente U73122 não altera a cinética dos espermatozoides in natura, e que, concentrações de 10 ou 20 μM deste reagente podem ser utilizadas em diluentes para criopreservação, uma vez que previnem a capacitação prematura e reação acrossomal induzidas durante este processo, sem alterar a cinética e a integridade das membranas espermáticas.