Efeito dos diferentes meios de cultura sobre o metabolismo de raízes transgênicas (RI T-DNA) de cenoura (Daucus carota L.) e de trevo (Trifolium repens L.) com ou sem micorriza

Abstract

Apesar dos benefícios dos fungos micorrízicos arbusculares (FMA) para as plantas, a impossibilidade do cultivo desses fungos in vitro, limitou os estudos metabólicos e a produção de inóculos, pois o FMA só se propaga na presença de tecido vegetal metabolicamente ativo. Entretanto, com a manipulação genética é possível modificar raízes, introduzindo DNA de plasmídio bacteriano indutor de enraizamento (Ri T-DNA), de maneira que as raízes se propaguem em meio de cultura, e que podem ser usadas como substrato para a colonização por FMA. No entanto, pouco é conhecido sobre o metabolismo destas raízes e sua simbiose com o FMA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o meio mais adequado para a propagação das raízes transgênicas (RT) de cenoura (Daucus carota L.) e trevo (Trifolium repens L.), e seu metabolismo em simbiose ou não com FMA (Glomus clarum). Para isto foram desenvolvidos três experimentos. No primeiro as raízes foram cultivadas em diferentes meios: mínimo, MS e mínimo modificado, com citrato de amônio ou uréia. Entre os quatro meios utilizados, os com nitrogênio na forma inorgânica, foram os que mais favoreceram o crescimento das duas espécies de RT. O meio MS foi o que apresentou maior acúmulo de N-amino livre, N- nitrato e N-amônio, em ambas raízes. As proteases nas RT de cenoura e de trevo desenvolvidas nos diferentes meios de cultura, de um modo geral, apresentaram atividade aos 60 minutos de incubação, em solução de albumina, estabilizando a atividade neste tempo, com exceção do meio MS, que apresentou maior atividade proteolítica aos 120 minutos. De acordo com estes resultados os meios mais propícios à propagação de RT de cenoura e de trevo foram o mínimo e o MS, constituídos com N na forma inorgânica de NO< ou associado ao NH& respectivamente. Com estas informações foram desenvolvidos os outros dois experimentos, utilizando apenas o meio mínimo e o MS, com ou sem fungo micorrízicos. O delineamento estatístico utilizado foi em um fatorial inteiramente ao acaso, sendo os tratamentos arranjados em fatorial 2X2X3 (dois meios, presença ou ausência de FMA e três coletas), tanto para as raízes de cenoura como de trevo. As RT de cenoura e de trevo, apresentaram maior teor de N-amino, e N- NH.& quando foram cultivadas em meio MS, com maior teor no início do crescimento vegetativo. Quanto aos teores de açúcares solúveis, também apresentaram maior acúmulo no estádio de máximo crescimento vegetal, porém, apresentaram comportamento diferenciado entre as espécies de RT. As raízes de cenoura apresentaram maior acúmulo no meio mínimo enquanto as raízes de trevo apresentaram maior acúmulo no meio MS. A atividade da GS foi detectada apenas na primeira coleta, tanto para as raízes de cenoura como para as de trevo, a maior atividade ocorreu em meio MS, que apresentava uma maior concentração de N. A atividade das enzimas GOGAT, GDHa e GDHd, aumentaram na coleta 2 (aos 84 dias de cultivo das RT), com o desenvolvimento do processo de senescência das raízes. O maior aumento da atividade das proteases foi observado quando as RT foram cultivadas em meio MS, sendo mais acentuado na coleta 3 (132 dias de cultivo das RT), quando as raízes encontravam-se em senescência. O G. clarum favoreceu o aumento da atividade das proteases nas raízes de cenoura e reduziu nas de trevo. A proteína do extrato enzimático das enzimas de assimilação do N e extrato das proteases, foram maiores para as RT cultivadas em meio MS, devido a concentração de N neste meio. O G. clarum em associação com as raízes de cenoura influenciou no maior teor de proteína nos dois extratos. Os resultados demostraram que quando as RT apresentaram a máxima produção de biomassa (aos 49 dias do cultivo das raízes), exauriram os nutrientes do meio de cultivo e principalmente o carbono, influenciando no desencadeamento do processo de senescência (84 dias). Com o aumento da senescência (132 dias) das raízes, ocorreu uma maior degradação dos tecidos radiculares, que foi caracterizado pelo aumento das enzimas catabólicas, proteases e GDHd, que atuaram na degradação das proteínas, liberando os aminoácidos, produzindo esqueletos de carbono e energia, que possivelmente foram utilizados para reincorporar o N- Reciclado, através da enzima GDHa e da GOGAT. Os resultados indicam que a via GS/GOGAT, característica dos tecidos vegetais deixa de atuar em sincronismo, sendo substituída por GDH/GOGAT em condições de estresse ou senescência, quando há excesso de amônio.