Sistemas modelos de formação de lignina utilizando recursos sintéticos e celulares de Eucalyptus grandis (Hill ex Maiden)

Abstract

O objetivo principal desse trabalho foi a elaboração de modelos para o estudo da lignificação. Mudas de Eucalyptus grandis, obtidas a partir da germinação de sementes in vitro, foram desenvolvidas visando à obtenção de explantes de segmentos caulinares. Para tal, foram testadas as auxinas TDZ, 2,4-D, ANA e AIA. Não foi constatada a formação de calos nos tratamentos contendo 50,0 μM de 2,4-D; 3,0 μM de TDZ e na ausência de regulador de crescimento. Após 210 dias, foi selecionado um calo formado no tratamento contendo 2,5 μM de TDZ. Este calo foi cultivado no mesmo tratamento, porém, em meio líquido e sob agitação por 60 dias a 25 ºC no escuro, para indução da formação de lignina da parede celular e ligninas extracelulares. Após este período, as células em suspensão foram submetidas aos seguintes tratamentos: meio MS suplementado com sacarose, 2,4-D + cinetina, ácido p-cumárico e sem suplemento extra. As células permaneceram nestes tratamentos por 30 dias. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com 4 repetições, sendo a parcela experimental constituída por um Erlenmeyer contendo 125 ml de cultura de células em suspensão. Para extração e determinação da lignina da parede celular, foi utilizada a técnica baseada na lignina tioglicolato. A concentração de lignina da parede das células e das ligninas extracelulares foi avaliada em UV. Para verificar a normalidade dos dados foi usado o teste Lilliefors. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A maior concentração de lignina na parede celular (371.4200 ppm) foi verificada no tratamento EG1pc 0,0584 μM de sacarose. Ligninas extracelulares também foram analisadas com o reagente Wiesner, RMN H e RMN13C. A maior concentração (134.3167 ppm) de ligninas extracelulares foi constatada no tratamento EG3e (100μM ácido p-cumárico). Porém, os resultados de RMN H e RMN13C, não permitiram caracterizar a polimerização de lignina extracelular pura. No estudo da lignificação utilizou-se a técnica de polimerização desidrogenativa (DHP) in vitro. DHPs foram elaborados em meios obtidos a partir de filtrados das culturas de células em suspensão em diferentes tratamentos. Para cada tratamento, foi adicionado H2O2, peroxidase ou H2O2 + peroxidase. A produção de DHPs foi efetuada em meio MS (sem o prévio cultivo de células) como substrato no qual três soluções (álcool coniferílico ou sinapílico, peroxidase e o H2O2) foram adicionadas por gotejamento. Os produtos das DHPs, juntamente com os filtrados, foram analisados por IV e RMN H. Nos tratamentos realizados em meio MS sem o prévio cultivo de células em suspensão, os DHPs produzidos foram analisados por RMN H e RMN13C. Os espectros de IV não apresentaram sinal na região de 1500 cm-1, bem como as análises em RMN H mostraram que não houve formação de DHPs. Porém, nas suspensões celulares tanto em RMN H quanto RMN13C apresentaram sinais de DHP, exceto no tratamento com DHP1c (MS + 0,0584 μM sacarose). As análises em RMN H apresentaram: 3.86; 6.92 e 4.71 ppm e de RMN13C: 134,26; 88,21; 65,17; 55,90 e 20,75 ppm.