Análise genética e desenvolvimento de um método de diagnóstico, baseado em PCR, para detecção de Cyniclomyces guttulatus em fezes de cães

Abstract

O significado das infecções fúngicas dos animais tem sido ignorado por muitos veterinários. No entanto, problemas recentes causados por doenças fúngicas de destaque, por exemplo, a esporotricose de felinos e humanos no Brasil e a criptococose zoonótica em todo o mundo, demonstraram a necessidade de reverter essa tendência negativa há muito estabelecida. A levedura ascomicética Cyniclomyces guttulatus é a única espécie atualmente incluída no gênero Cyniclomyces. Tradicionalmente, era vista como um componente comensal da microbiota intestinal de coelhos e outros herbívoros. O aumento do interesse em C. guttulatus se desenvolveu com base em relatos da Europa, Ásia, América do Norte e Brasil, sugerindo que C. guttulatus representava um patógeno emergente e / ou oportunista de cães, onde sua presença em números elevados estava ligada a sinais clínicos, incluindo diarreia, gastroenterite e colangiohepatite. No entanto, pesquisas recentes conduzidas na Holanda e nos Estados Unidos argumentaram que a presença dessa levedura em cães que sofrem de doença gastrintestinal é provavelmente circunstancial e não tem relevância clínica. O diagnóstico de C. guttulatus em fezes e / ou em material clínico é realizado principalmente usando análises microscópicas e microbiológicas baseadas em cultura. Em uma minoria de estudos, a identificação definitiva das colônias da levedura foi feita utilizando a amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de um fragmento do gene 26S rDNA (codifica a subunidade maior do RNA ribossomal). O presente estudo relata o desenvolvimento de métodos moleculares inovadores para detecção e caracterização de culturas de leveduras e para a detecção e caracterização independente de cultura de C. guttulatus diretamente de fezes de cães. A disponibilidade dos ensaios servirá para reduzir as dúvidas sobre a validade dos diagnósticos morfológicos e pode reduzir o tempo para confirmação do diagnóstico molecular para até 48 horas, ao invés do prazo atual de 7 a 10 dias. A genotipagem de uma coleção de isolados de porquinho-da-índia (n = 1), coelhos (n = 20) e cães (n = 8) utilizou amplificação por PCR e sequenciamento de fragmentos das sequências que codificam as subunidades maior (26S) e menor (18S) do RNA ribossomal, as subunidades RPB1 e RPB2 da RNA polimerase II, a citocromo oxidase II e as regiões espaçadoras internas transcritas (ITS). Alinhamento de sequências e avaliação da similaridade entre os nucleotídeos para a maioria das sequências serviram para apoiar dados de estudos anteriores que sugeriram a possível existência de duas espécies de Cyniclomyces. Curiosamente, o uso da região ITS indicou que pode haver pelo menos três espécies de Cyniclomyces. Conclui-se que a identificação das novas espécies de Cyniclomyces questiona grande parte dos dados produzidos até o momento em relação à patogenicidade desse organismo. Prevê-se que os resultados deste trabalho sirvam para estimular uma expansão do estudo do gênero Cyniclomyces e, como tal, contribuam significativamente para a compreensão do seu papel na saúde dos cães.