Abordagens enzimáticas e proteômicas da resposta de fungos artropodopatogênicos submetidos a estresses e na infecção contra Rhipicephalus microplus

Abstract

Na última década, estudos envolvendo a aplicação de Metarhizium spp. e Beauveria bassiana no controle de Rhipicephalus microplus têm crescido de forma exponencial. O presente estudo avaliou a influência de repiques sucessivos em meio de cultivo sintético (batata-dextrose-ágar - BDA) na atividade enzimática e efeitos sobre virulência para R. microplus em três isolados de Metarhizium. Para isso, amostras foram obtidas do cultivo inicial (Início) e após o décimo (10º ciclo) e vigésimo (20º ciclo) repiques. Apresentando consequências individualizadas entre os isolados, alterações na macromorfologia, diminuição do crescimento radial e produção conidial, além de redução de virulência e atividades de Pr1, Pr2 e lipase foram majoritariamente detectadas após o 20º ciclo. Em outra vertente, foi-se também estudado o efeito de um agente oxidante (menadiona - MEN), potente indutor de espécies reativas de oxigênio, no desenvolvimento, virulência para R. microplus, atividade enzimática e secreção proteica de M. anisopliae sensu stricto (s.s.). Por ser pouco tolerante, para todos os experimentos, uma subdosagem (50% da CL50) de MEN foi inicialmente adicionada aos cultivos. Em meio sólido suplementado com MEN, mudanças relevantes no desenvolvimento das colônias, além de atividades enzimáticas conidiais foram detectadas. Em contrapartida, de forma surpreendente, melhorias significativas no percentual de mortalidade de larvas também ocorreram. Nas análises de meio basal líquido acrescido de cutícula de R. microplus, num total de 654 proteínas identificadas, 31 foram up- e down-reguladas, estando principalmente relacionadas à atividade antioxidante (catalase), patogenicidade (como Pr1B, Pr1D e Pr1K), reparo celular e morfogênese. Por fim, a atividade e secreção de proteínas (secretoma) de Beauveria bassiana s.l. durante a infecção em R. microplus e sua comparação com condições normais de crescimento foram reportadas. A partir de meio basal líquido acrescido de cutícula de R. microplus, e aplicando uma tecnologia multidimensional de identificação de proteínas, de um total de 236 proteínas, 32 proteínas foram identificadas em ambas as condições de estudo e 50 exclusivamente na condição de infecção, sendo estas atribuídas a diferentes aspectos como adesão ao hospedeiro, penetração cuticular, defesa fúngica e estresse. Nesse contexto, um maior número de proteínas detectadas com atividade hidrolítica, classe enzimática de todas as enzimas degradadoras de cutícula, como lipases e proteases, foram identificadas e validadas através de ensaios enzimáticos. Em suma, destaca-se que o repiques sucessivos e o estresse oxidativo, assim como o desconhecimento dos principais metabólitos produzidos durante a infecção por B. bassiana, ainda limitam prospecções futuras para o biocontrole, em especial à aplicação e ao monitoramento de produtos à base de fungos artropodopatogênicos no uso para carrapatos.