Detecção de Anaplasma platys em cães e em carrapatos: padronização de qPCR e análise epidemiológica no Estado do Rio de Janeiro, Brasil e na região ocidental de Cuba

Abstract

platys, e investigar a circulação deste agente em cães na microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, e cães e carrapatos em duas províncias da ilha de Cuba, analisando aspectos epidemiológicos associados à infecção causada por esta bactéria em cães. Um novo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) foi padronizado com alvo no gene citrato sintase (gltA) para a identificação de A. platys em cães naturalmente infectados. Os oligoiniciadores e a sonda foram desenhados para amplificar um fragmento de 84 pares de base baseado em sequências do gene gltA de A. platys disponíveis no GenBank. 186 amostras de sangue de cães da microrregião de Itaguaí, Rio de Janeiro, Brasil, foram testados pela qPCR. As mesmas amostras foram testadas pela citologia e reação em cadeia da polimerase nested (nPCR, 16S rDNA) para determinar o desempenho da qPCR frente à essas técnicas. 17,20% das amostras testadas pela qPCR foram positivas, significativamente mais do que detectado pela nPCR (13,98%). A técnica de qPCR foi mais específica que a citologia, em virtude dos resultados falsopositivos obtidos pela microscopia óptica. A prevalência de A. platys em cães da microrregião de Itaguaí foi de 14,4%. Cães com menos de seis meses, infestados por carrapatos, que possam maior tempo restrito ao ambiente doméstico e sem abrigo são fatores associados a infecção por este hemoparasito em cães na região do estudo. Durante investigação de A. platys realizada em Cuba, 100 amostras de sangue foram coletadas de cães residentes em quatro cidades localizadas nas províncias de Habana e Mayabeque. Ao inspecionar os animais, carrapatos encontrados foram coletados, identificados e criteriosamente agrupados, formando um total de 49 pools. Amostras de DNA extraídas do sangue dos cães e de carrapatos foram submetidas a nPCR (16S rDNA). Amostras positivas na nPCR foram também submetidas a PCR convencional (gene gltA), e os produtos foram sequenciados. Somente a espécie Rhipicephalus sanguineus sensu lato foi encontrada em cães cubanos, e 10,2% (n=5/49) desses carrapatos somado aos 16,0% (n=16/100) de cães foram considerados positivos para A. platys. Todas as sequências analisadas dos genes gltA e 16S rDNA, respectivamente, mostraram uma identidade de 99-100% com sequências de A. platys reportadas em outros países. A análise filogenética mostrou dois clusters definidos para o gene 16S rDNA e três clusters definidos para o gene gltA. Com base no gene gltA, a sequência de aminoácidos deduzidos demonstrou dois pontos de mutações não-sinônimas nas posições 88 e 168 comparados com sequência de referência DQ525687. Um estudo preliminar sobre os aspectos epidemiológicos associados com a infecção por A. platys demonstrou nenhuma associação estatística com as variáveis avaliadas (p > 0,05). O presente estudo além de relatar a primeira evidência de A. platys em ambos cães e carrapatos em Cuba, também apresenta pela primeira vez o desenvolvimento de um novo método de qPCR que contribui para o avanço da pesquisa envolvendo A. platys. O estudo epidemiológico realizado no Brasil permitiu identificar fatores importantes na ocorrência da anaplasmose canina, enquanto em Cuba, pode-se concluir que mais investigações são necessárias para avaliar quais os fatores decisivos na transmissão e dispersão de A. platys nesse país.