Avaliação dos perfis protéico e lipídico na resposta de Rhipicephalus microplus à infecção com fungos

Abstract

O trabalho avaliou os perfis protéico e lipídico de fêmeas ingurgitadas de Rhipicephalus microplus após infecção com Metarhizium anisopliae s.l., Beauveria bassiana ou Fusarium oxysporum. Os tratamentos foram imersão ou inoculação da suspensão conidial em R. microplus. A hemolinfa foi coletada 24 e 48 horas após os tratamentos. O plasma foi separado dos hemócitos por centrifugação e os hemócitos resuspensos em tampão fosfato pH 7,2. A concentração de proteína total foi determinada em ambas as frações da hemolinfa e os hemócitos quantificados. O plasma da hemolinfa foi filtrado em membrana de 100 kDa e 10 kDa, sendo analisados por eletroforese e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O proteoma do plasma da hemolinfa (tratamento por inoculação) foi avaliado por gel 2D. Foram observadas variações na quantidade de proteína total de ambas as frações da hemolinfa, na quantidade de hemócitos bem como na intensidade de proteínas/peptídeos expressos no plasma da hemolinfa. Nos hemócitos, os entomopatógenos reduziram a quantidade de serpinas, enquanto F. oxysporum causou aumento. No gel 2D foram observadas variações na expressão bem como na ausência/presença de proteínas entre os grupos. O plasma da hemolinfa teve sua atividade antimicrobiana testada contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus e contra o fungo utilizado no tratamento das fêmeas ingurgitadas. A hemolinfa coletada 48 horas após o tratamento por imersão com B. bassiana apresentou atividade anti-B. bassiana com 48 horas de avaliação. Esta hemolinfa foi submetida à coluna Superose de CLAE e o pico coletado analisado na coluna analítica C18. As frações coletadas da C18 apresentaram atividade anti-B. bassiana, porém não apresentaram atividade contra Candida albicans. Essas frações foram analisadas por Maldi-Tof e a maioria delas apresentou um íon com razão m/z 1.119,5; no entanto, outros íons podem estar envolvidos com essa atividade antimicrobiana. Os lipídeos presentes no plasma da hemolinfa, nos hemócitos e no corpo gorduroso foram extraídos e analisados por cromatografia em camada delgada (CCD) ou CCD de alta performance para lipídeos neutros e fosfolipídeos. As classes de lipídeos neutros encontradas no plasma da hemolinfa foram colesterol-éster, colesterol (CHO) e ácidos graxos (AG), que sofreram alterações em função do fungo utilizado, tipo de tratamento e tempo de observação. Os fosfolipídeos encontrados foram fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina, que não foram significativamente alterados após a infecção fúngica. Nos hemócitos, as mesmas classes de lipídeos foram encontradas e B. bassiana alterou os fosfolipídeos, enquanto M. anisopliae s.l. alterou os AG e CHO. O corpo gorduroso apresentou, além destas classes de lipídeos neutros, o triacilglicerol, que aumentou significativamente 48 horas após a inoculação com M. anisopliae s.l. A atividade lipase no corpo gorduroso foi mensurada, sendo evidenciado um aumento 48 horas após a inoculação, principalmente no grupo inoculado com Metarhizium. Portanto, os resultados demonstraram alterações na expressão de proteínas no plasma da hemolinfa e nos hemócitos após inoculação com os fungos, imunossupressão dos hemócitos, indução de peptídeos com atividade antimicrobiana após infecção com B. bassiana, além de alterações no perfil lipídico de R. microplus após infecção. No entanto, maiores estudos são necessários para o entendimento dessas alterações.