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Tipo do documento: Tese
Título: Diagnóstico dos gêneros Ehrlichia e Babesia em cães domésticos e caracterização de Anaplasma platys na Região Metropolitana do Rio de Janeiro
Autor: Lisbôa, Raquel Silva
Orientador(a): Massard, Carlos Luiz
Primeiro coorientador: Oliveira, Carina Elisei de
Segundo coorientador: Fonseca , Adivaldo Henrique da
Palabras clave: Multiplex PCR, Co-infection, Sequencing.;PCR Multiplex, Coinfecção, Sequenciamento
Área(s) do CNPq: Medicina Veterinária
Idioma: por
Fecha de publicación: 14-abr-2010
Editorial: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Sigla da instituição: UFRRJ
Departamento: Instituto de Veterinária
Programa: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Citación: Lisbôa, Raquel Silva. Diagnóstico dos gêneros Ehrlichia e Babesia em cães domésticos e caracterização de Anaplasma platys na Região Metropolitana do Rio de Janeiro. 2010.111 f. Tese (Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.
Resumen: Os cães podem se infectar com diversos hemoparasitos, sendo muito comum a ocorrência de coinfecções entre as espécies Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys e Hepatozoon canis, visto que possuem o mesmo carrapato vetor. Este estudo teve como objetivos delinear uma técnica de PCR multiplex para diagnosticar simultaneamente microrganismos dos gêneros Ehrlichia e Babesia em amostras de sangue de cães e realizar a caracterização parcial de fragmentos do gene 16S rRNA de agentes da família Anaplasmataceae e do gene 18S rRNA de Babesia detectados em algumas amostras positivas pela PCR, comparando as sequências obtidas com as sequências de outras cepas depositadas previamente no GenBank. O DNA total de 119 amostras de sangue foi extraído. Destas, 40 foram selecionadas por apresentar inclusões citoplasmáticas em leucócitos e/ou plaquetas sugestivas de infecção por agentes da família Anaplasmataceae (1E a 40E), 37 por apresentar formas parasitárias de piroplasmídeos (1B a 37B), duas por apresentar estruturas de ambos os agentes (M1 e M2) e, finalmente, 40 amostras com diagnóstico parasitológico negativo e exame hematológico sem alterações. Todas estas amostras foram testadas por PCR, para a confirmação da ausência ou presença destes hemoparasitos, e depois utilizadas no delineamento da PCR multiplex. Nas reações de PCR multiplex utilizou-se os oligonucleotídeos iniciadores A17/EC3 que amplificam um produto de aproximadamente 600pb de uma porção do gene 16S rRNA de espécies de Ehrlichia e os oligonucleotídeos iniciadores PIRO-A1/PIRO-B que amplificam um produto de aproximadamente 450pb de uma porção do gene 18Sr RNA de espécies de Babesia. A validação da PCR multiplex foi realizada por PCR multiplex em tempo-real. A PCR multiplex foi capaz de detectar simultaneamente os dois agentes em uma amostra de DNA de um cão naturalmente coinfectado e todas as infecções individuais por Babesia, mas não detectou todas as infecções por Ehrlichia. A PCR multiplex em tempo real foi mais sensível em detectar tanto infecções únicas quanto coinfecções, além de misturas de DNA positivo para os dois agentes. Os resultados dos sequenciamentos confirmaram a identidade dos isolados, e que os oligonucleotídeos PIRO-A1/PIRO-B amplificaram também, o DNA de Hepatozoon canis. As análises filogenéticas indicaram que as espécies de E. canis, A. platys, B. canis e H. canis encontradas neste estudo possuem similaridades próximas com sequências previamente depositadas no GenBank, formando grupos monofiléticos.
Abstract: Dogs can be infected with various hemoparasites, and the occurrence of co-infections between Ehrlichia canis, Babesia canis, Anaplasma platys, and Hepatozoon canis species is very common, since they have the same tick vector. The objectives of this study were to delineate a multiplex PCR technique for the simultaneous diagnostic of microorganisms of Babesia and Ehrlichia genera in canine blood samples, and to realize the partial characterization of fragments of the 16S rRNA gene of the family Anaplasmataceae agents and, of 18S rRNA gene of Babesia detected in some samples PCR-positive, comparing the sequences obtained with sequences of other strains previously deposited in GenBank. Total DNA of 119 blood samples was extracted, of these, 40 were selected by showing cytoplasmatic inclusions in leukocytes and/or platelets suggesting infection by agents of Anaplasmataceae family (1E to 40E), 37 by showing piroplasms (1B to 37B), and two by presenting structures of both agents (M1 and M2), and finally, 40 samples with negative parasitological diagnostic and hematological exam without alterations. All these samples were tested by PCR to confirm the absence or presence of these hemoparasites, and them utilized in the multiplex PCR delineation. In multiplex PCR reactions the primers A17/EC3 were used to amplify an approximately 600bp region of the 16S rRNA gene of Ehrlichia species and the primers PIRO-A1/PIRO-B were used to amplify an approximately 450bp region of the 18S rRNA gene of Babesia species. Validation of multiplex PCR was performed by real time multiplex PCR. The multiplex PCR was able to simultaneously detect both agents in a DNA sample of a dog naturally co-infected and all the single infections by Babesia, but does not detected all the Ehrlichia infections. The real-time multiplex PCR was more sensitive in detect both single and also co-infections, as well as positive DNA mixtures for the two agents. The sequencing results confirmed the isolates identity, and that the primers PIRO-A1/PIRO-B also amplified the DNA of Hepatozoon canis. Phylogenetic analysis indicated that E. canis, A. platys, B. canis and H. canis species found in this study showed close similarities with sequences previously deposited in GenBank, forming monophyletic groups.
URI: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9808
Aparece en las colecciones:Doutorado em Ciências Veterinárias

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