O líquido do apoplasto de cana-de-açúcar modulando a expressão de genes na bactéria diazotrófica endofítica Herbaspirillum rubrisubalbicans estirpe HCC103

Abstract

Alternativas que diminuam a necessidade de fertilizantes nitrogenados na cultura da cana-de-açúcar, os custos e os danos ao ambiente sem reduzir a produção são fundamentais para a sustentabilidade da cultura. Dentre essas alternativas destaca-se o uso de bactérias diazotróficas, que são capazes de realizar o processo da fixação biológica de nitrogênio (FBN) quando em associação com os tecidos da planta. Diversas espécies de bactérias são capazes de realizar esse processo tais como a Herbaspirillum rubrisubalbicans estirpe HCC103. No entanto, os mecanismos desta interação bactéria-planta ainda são pouco conhecidos. Na busca pelo conhecimento da interação planta-bactéria, a genômica funcional baseada em análises transcriptômicas tem sido utilizada explorando o papel dos exsudatos radiculares, da seiva vegetal e do fluido do apoplasto. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o papel do líquido do apoplasto na expressão global de genes na bactéria Herbaspirillum rubrisubalbicans estirpe HCC103. Para tanto, o estudo foi dividido em dois capítulos. O primeiro capítulo teve como objetivo avaliar e selecionar genes normalizadores adequados para estudos de expressão gênica por RT-qPCR da estirpe HCC103. Neste sentido, foram avaliados os níveis de expressão de 5 genes candidatos a normalizadores (rpoA, gyrA, dnaG, recA e gmK) e 8 genes alvos envolvidos no metabolismo de carbono, após o crescimento da bactéria no caldo de 4 variedades de cana-de-açúcar (RB867515, SP701143, RB92579 e IACSP95-5000) e de 3 fontes de carbono (aconitato, malato e glicose). A análise da estabilidade da expressão gênica realizada com os programas GeNorm e Normfinder indicou os genes dnaG e gyrA como os mais estáveis e portanto adequados para uso como genes normalizadores nas análises de RT-qPCR da estirpe HCC103. O capítulo 2 teve por objetivo o estudo da expressão gênica diferencial (método de RNA-Seq) da estirpe HCC103 cultivada na presença do líquido do apoplasto da cana-de-açúcar extraído de colmos da variedade RB867515 com 12 meses de idade. A estirpe HCC103 foi cultivada em meio JNFb líquido a 30°C e 150 rpm até a metade da fase de crescimento exponencial, quando o caldo bacteriano foi divida em 3 porções equivalentes e a estas adicionado os seguintes tratamentos, respectivamente: 50% de água destilada (MA); 50% de líquido do apoplasto (MLA); 50% de meio JNFb novo (MM). Duas horas após a aplicação dos tratamentos e incubação a 30°C e 150 rpm, as células bacterianas foram coletadas, o RNA foi extraído, as bibliotecas de cDNA construídas, e o sequenciamento foi realizado na plataforma Ion-Proton. Para a identificação dos genes diferencialmente expressos (GDE) foi empregado o pacote de bioinformática CLC. A anotação funcional de GDE baseados na ontologia genética foi realizada com os programas Blast2GO, WebMGA (Classificação funcional – COG). Todos os genes diferencialmente expressos foram anotados através do programa de bioinformática Artemis. Os resultados mostraram que as categorias funcionais 7 Tradução, estrutura ribossomal e biogênese; Transcrição; Mecanismos de tradução de sinal e Transporte de aminoácidos se destacaram em número de genes reprimidos. Em contraste, as categorias de Metabolismo e transporte de carboidrato; de aminoácido, Mecanismos de transdução de sinal e Transcrição apresentaram maior número de genes induzidos nas duas comparações (vs. MA e vs. MM). Na classe produção e conversão de energia destacam-se genes que codificam para enzima nitrato redutase os quais foram altamente induzidos na presença do líquido do apoplasto em ambas as comparações. Em conclusão, os resultados mostraram uma variedade de genes envolvidos na interação planta bactéria em resposta à presença do líquido do apoplasto, como por exemplo, genes que codificam para proteínas do sistema de secreção do tipo 6 (SST6), flagelo e mecanismos de transdução de sinais. Este trabalho, pioneiro, deverá apoiar pesquisas futuras sobre a interação de Herbaspirillum rubrisubalbicans estirpe HCC103 com a planta de cana-de-açúcar e possivelmente permitir a identificação de biomarcadores que auxiliem na maximização do potencial biotecnológico da bactéria como biofertilizante em diferentes variedades de cana-de-açúcar