Produção, concentração e caracterização parcial de extrato celulolítico produzido por linhagem fúngica mutante

Abstract

A produção de enzimas para uso em diferentes áreas da agroindústria de alimentos mostra perspectivas futuras promissoras, devido às várias características inerentes à ação das enzimas que são compostos naturais, biodegradáveis e capazes de desempenhar reações específicas com melhor qualidade. Entre as enzimas mais utilizadas pelo setor de alimentos estão as celulases, um complexo de enzimas que atuam de forma sinérgica sobre a hidrólise das ligações glicosídicas β-1,4 das moléculas de celulose, e possuem várias aplicações industriais neste setor, como na extração de óleos vegetais, na maceração de frutas e na clarificação de sucos. Dentro deste contexto, este trabalho teve como objetivo produzir, concentrar e caracterizar parcialmente um extrato celulolítico obtido por linhagem fúngica mutante de Aspergillus niger. A produção foi realizada por fermentação no estado sólido (FES) em colunas aeradas, utilizando como substrato farelo de trigo triturado umidificado com solução de (NH4)2SO4 em HCl 0,1N e celobiose, como indutor. O extrato celulolítico consistiu de uma mistura de extratos obtidos em 3 ensaios fermentativos diferentes, selecionados em trabalhos anteriores como as melhores condições para produção de cada uma das enzimascarboximetilcelulase (CMCase), β-glicosidase e celulase em papel de filtro (FPase). Durante a caracterização do extrato enzimático, além da atividade das celulases, também era avaliado o teor de proteína, a presença de protease e de enzimas correlatas à ação de celulases como xilanase e poligalacturonase. Para concentração do extrato enzimático foram realizadas três diferentes estratégias: ultrafiltração em um sistema de quadro e placas em aço inox, utilizando uma membrana de polietersulfona com massa molar de corte de 20 kDa e área de 0,014m2; precipitação com sulfato de amônio utilizando saturações de 20%, 40%, 50%, 60%, 80% e liofilização. O processo de ultrafiltração foi o que obteve o melhor resultado, purificando parcialmente a amostra e proporcionando uma recuperação das atividades enzimáticas entre 75% e 99% para todas as atividades avaliadas, exceto FPase. A análise eletroforética em SDS-PAGE demonstrou a presença de 15 bandas visíveis de proteínas no extrato celulolítico com pesos moleculares que compreendem uma faixa entre 13,3 e 104,6 kD. O teste de zimografia foi realizado para as celulases e enzimas correlatas, bem como para protease, no entanto somente para esta última, as condições testadas foram adequadas tornando-se possível identificar bandas em 88, 103 e 145 kDa. A efetiva ação das enzimas β-glicosidase e xilanase na hidrólise de celobiose e xilana, respectivamente,foi comprovada em cromatografia de camada fina. Além disso, a temperatura e pH ótimos de atuação de carboximetilcelulase e β-glicosidase foram determinados utilizando o delineamento composto central rotacional 22, com 4 pontos centrais. A análise dos resultados de ambas as enzimas demonstrou que as variáveis eram significativas, a um nível de confiança de 95%. Com base nas condições estudadas, concluiu-se que as faixas de pH e temperatura ótimos para a atuação eficiente e conjunta de CMCase e β-glicosidase estão entre 3,7 a 5,5 e 60 a 65 °C, respectivamente.