Influência dos métodos de conservação sobre a recuperação e a frequência de amplificação de marcadores mitocondriais e nuclueares de carrapatos das espécies Amblyomma Parvum e Amblyomma Sculptum (Acari: Ixodidae)

Abstract

O estudo de carrapatos e doenças transmitidas por eles é cada vez mais dependente da utilização de técnicas de biologia molecular que são empregadas na detecção de patógenos, e a acurada identificação desses artrópodes, em particular os estágios imaturos. A aplicação bem-sucedida dos métodos moleculares, principalmente, a reação em cadeia da polimerase (PCR), só pode ser alcançada se o DNA presente no carrapato foi eficazmente preservado e extraído de forma eficiente. O estudo comparou três fixadores (RNAlater, sais de zinco (ZN) e isopropanol) avaliando a sua capacidade de preservar DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear de larvas e ninfas de Amblyomma parvum e larvas de Amblyomma scultptum. O DNA foi extraído dos carrapatos, em tempos entre 72h e 12 meses após a fixação por meio da técnica de fenol-clorofórmio e lise alcalina (“Hot Shot”) e examinadas usando ensaios de PCR para sequências nucleares (espaçador interno transcrito 2; ITS2) e mitocondriais (12S rDNA, subunidade 1 do citocromo c oxidase (COI) e D-loop). A eficiência de amplificação foi analisada quantitativamente (número de amostras que produziram “amplicon”) e qualitativamente (intensidade relativa das bandas observadas em géis de agarose). Foi observado que a sequência ITS2 foi amplificada na maioria (93,39%, n= 283/303) das amostras em cada um dos três fixadores, embora tenham sido observadas diferenças qualitativas, particularmente com A. sculptum preservado em ZN. Em contraste, a fixação em isopropanol afetou negativamente a capacidade de amplificar as sequências dos marcadores mitocondriais de A. parvum e também resultou na amplificação inferior (qualitativa), do alvo D-loop com A. sculptum. Esses efeitos foram observados em amostras fixadas por apenas 72 horas. Os efeitos prejudiciais de isopropanol também foram observados igualmente em amostras extraídas usando um método de lise alcalina (“HotShot”). As amostras de larvas de A. parvum preservadas em RNAlater durante 30 meses, mostrou uma eficácia de amplificação de 100% nos ensaios para ITS2 e COI, independentemente do método de extração usado. Sequências mitocondriais são um componente central da maioria das pesquisas moleculares com carrapatos. Os resultados deste estudo indicam que isopropanol deve ser evitado como um fixador para fases imaturas de carrapatos. Em vez disso, o uso de RNAlater é recomendado, a fim de permitir a recuperação consistente de mtDNA amplificáve