Cultivo de Borrelia burgdorferi (Spirochaetales: Spirochaetaceae) em células embrionárias de Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae).

Abstract

As culturas celulares oferecem um simplificado sistema de observação que pode ser particularmente útil para estudos de microrganismos intracelulares e epicelulares. O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária in vitro de células embrionárias do carrapato Rhipicephalus sanguineus para cultivo da espiroqueta Borrelia burgdorferi, cepa americana G39/40. A cultura foi estabelecida a partir de ovos embrionados de fêmeas ingurgitadas de R. sanguineus com 12 dias após o ínicio da postura, utilizando o meio de cultivo Leibovitz´s L- 15B, suplementado com 20% de soro fetal bovino inativado, 10% de caldo triptose fosfato, 0,1% fração V de albumina bovina, 1% de glutamina e 0,1% de antibiótico gentamicina, pH 6,8. Com a formação de uma monocamada celular, o meio de cultura inicial L-15B foi retirado dos tubos e trocado por meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) ou BSK com L-15B sem antibiótico. As espiroquetas previamente cultivadas em BSK foram contadas e inoculadas nos tubos, apresentando concentração final de aproximadamente 6,2 x 105 espiroquetas/mL. A contagem de B. burgdorferi dos tubos inoculados foi realizada quando o meio apresentou coloração amarela, indicativa de elevada acidez devido à multiplicação das espiroquetas. No terceiro dia após o início da cultura primária de células embrionárias de R. sanguineus, foi possível observar a fixação de agregados celulares na superfície dos frascos. A partir destes agregados, surgiram diversos tipos celulares, como grandes células fibroblastóides e estruturas semelhantes a vesículas e tubos. Na segunda semana, foi observado o aparecimento das células epitelióides ou redondas e, com 21 dias de cultivo, visualizou-se a formação de uma monocamada celular devido ao aspecto confluente das células. O meio de cultivo L-15B demonstrou ser eficiente para o desenvolvimento da cultura primária de células embrionárias de R. sanguineus. Houve grande multiplicação das espiroquetas cultivadas com células embrionárias quando comparada à concentração inicial, assim como das espiroquetas cultivadas na ausência das células de carrapato, observando-se um aumento em 100 vezes do número de B. burgdorferi. Sete dias após a inoculação, foram recuperadas maiores concentrações de B. burgdorferi nos tubos onde se utilizou somente o meio BSK, do que nos tubos onde foi utilizado BSK juntamente com Leibovitz´s L-15B. Independente dos meios de cultivo testados, a concentração final de B. burgdorferi dos tubos com células embrionárias de carrapato foi menor do que a dos tubos sem células embrionárias. Na observação dos tubos de cultivo à microscopia de contraste de fase, as espiroquetas apresentaram-se aderidas às células de carrapato epitelióides e fibroblastóides de maneira epicelular e com grande motilidade. As células embrionárias de R. sanguineus cultivadas em meio BSK, com ou sem inóculo de B. burgdorferi, pararam sua multiplicação, apresentaram degeneração na membrana e muitas desprenderam-se da superfície do frasco. As células cultivadas em meio BSK e L-15B continuaram a se multiplicar, muitas ainda estavam íntegras e aderidas ao frasco, com presença de tecidos em desenvolvimento, com menos células degeneradas e flutuantes que as cultivadas somente em BSK. A espiroqueta B. burgdorferi, cepa G39/40, aderiu, cresceu, multiplicou e apresentou grande motilidade nos cultivos com células embrionárias do carrapato R. sanguineus, utilizando meios BSK e Leibovitz´s L-15B.