Polimorfismo e expressão do gene da UCP2 no fígado de cabras em lactação

Abstract

As proteínas desacopladoras de membrana desacoplam a respiração celular da produção de ATP tendo papel importante no metabolismo energético do organismo. Polimorfismos em de genes codificantes para UCPs têm sido associados a características como cobertura de gordura e ganho de peso em bovinos de corte, e à obesidade em humanos. A grande mobilização de ácidos graxos no início da lactação pode influenciar na expressão da UCP2 mostrando que esta tem papel nos processos fisiológicos desta fase. Com o presente trabalho buscamos verificar se a expressão do gene UCP2 no fígado de cabras leiteiras varia durante o período inicial da lactação e sequenciar uma parte do gene da UCP2 em caprinos verificando a existência de polimorfismo nesta região. Para isso foram utilizadas 40 cabras (Capra hircus), todas fêmeas lactantes, das raças Saanen e Alpina das quais primeiramente foram coletados 10 mL de sangue. Posteriormente, para as análises de expressão gênica, 10 desses animais foram abatidos em diferentes estágios da fase inicial de lactação (dia do parto, 7, 21, 35 dias pós-parto) e uma amostra de tecido hepático foi coletada e armazenada em RNA-holder. O sangue total foi utilizado para extração de DNA e posterior amplificação de 4 fragmentos do gene UCP2 através da reação em cadeia da polimerase, os fragmentos amplificados foram então submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% (300V a 24hrs) para avaliar pequenas diferenças de tamanho entre as amostras. Posteriormente os fragmentos foram avaliados por PCR-RFLP quanto a diferenças no padrão de corte da enzima HaeIII. Três diferentes amostras de cada fragmento da região inicial do gene foram selecionadas ao acaso para o sequenciamento de bases. A partir das amostras de tecido hepático foi realizada a extração de RNA, o qual foi utilizado nas reações de PCR em tempo real com o composto fluorescente Syber Green. Para analisar se os genótipos encontrados tem influência sobre produção de gordura e procentagem de gordura no leite, foram realizadas análises de variância e estimação de contrastes. Para avaliar se a expressão variou, nos diferentes dias pós-parto foi realizada uma análise de regressão. Na região promotora foi encontrado um polimorfismo de tamanho de fragmento que origina dois alelos, o alelo A de tamanho maior e o B, de tamanho menor, estes foram avaliados quanto a sua influência sobre a porcentagem de gordura no leite e a produção de gordura, porém nenhum dos alelos influenciou estas características. As análises de PCR-RFLP mostraram uma diferença no padrão de corte da enzima entre as amostras no éxon 2 gene dando origem a dois alelos, C e N. Estes também foram avaliados quanto à influência sobre a porcentagem de gordura no leite e produção de gordura, porém nenhuma relação foi encontrada. Após o seqüenciamento as sequências foram comparadas entre si e um polimorfismo de nucleotídeo único foi encontrado no íntron 1 porém nenhuma enzima de restrição que reconhece este polimorfismo foi encontrada, impossibilitando a genotipagem de um número maior de animais por PCR-RFLP. As reações de PCR em tempo real revelaram que expressão da UCP2 no fígado foi maior no dia do parto e diminuiu gradativamente com o avançar da lactação até os 35 dias pós-parto.