Estudo da interação de Borrelia burgdorferi e Borrelia anserina (SPIROCHAETALES: SPIROCHAETACEAE) com diferentes linhagens de células de carrapatos (ACARI: IXODIDAE)

Abstract

O cultivo de tecidos de carrapatos pode contribuir para esclarecimento dos mecanismos de transmissão, aderência celular, migração no interior do vetor e interação do agente com células e tecidos do vetor. O presente estudo teve como objetivo verificar a associação de Borrelia burgdorferi e Borrelia anserina com diferentes linhagens de células de carrapato por citometria de fluxo, microscopia confocal e de fluorescência. Um total de oito linhagens de células embrionárias de carrapatos foi utilizado: Amblyomma variegatum AVL/CTVM17, Hyalloma anatollicum HAE8/CTVM8, Ixodes ricinus IRE/CTVM19, Ixodes scapularis IDE8 e ISE6, Rhipicephalus appendiculatus RA243 e RAE/CTVM1 e Rhipicephalus microplus BME/CTVM2. As espiroquetas foram marcadas com um marcador fluorescente de membrana (PKH67) para visualização e quantificação em citometria de fluxo, microscopia confocal e de fluorescência. As linhagens de células de carrapatos foram cultivadas a uma média de 2,7 x 10 5 células/poço em placas de 24 poços: para cada linhagem de células, três poços foram adicionados 10% de meio BSK-H e 90% de meio de células de carrapato, em outros três poços foram adicionados 90% de meio BSK-H e 10% de meio de células de carrapato. Nos ensaios, B. burgdorferi e B. anserina coradas foram adicionadas às células de carrapatos (razão de 10:1 Borrelia por célula de carrapato) e incubados a 30°C por 24h. A linhagem de células de carrapato com maior percentual médio de células fluorescentes na citometria de fluxo foi tratada com citocalasina D para elucidar o mecanismo de internalização da espiroqueta. O fluoróforo PKH67 se mostrou eficiente na marcação de B. burgdorferi e B. anserina, sem afetar a motilidade e a viabilidade bacteriana. Nas análises da citometria de fluxo, a linhagem RA243 do carrapato R. appendiculatus apresentou a maior taxa de infecção e a linhagem ISE6 do carrapato I. scapularis, juntamente com IRE19 do carrapato I. ricinus, apresentaram menores taxas de infecção para ambas as espiroquetas e em ambos os meios de cultivo. As células de carrapatos apresentaram maior percentual de fluorescência em concentrações mais baixas de BSK-H, que favoreceu a internalização de ambas espiroquetas nas células. Não houve diferença entre o percentual médio de células infectadas por B. anserina e o percentual médio das mesmas células infectadas por B. burgdorferi, em ambos os meios de cultivo. O tratamento da linhagem RA243 com citocalasina D inibiu drasticamente a percentagem média de células infectadas. Na análise morfológica das amostras, houve uma estreita relação entre as espiroquetas e todas as linhagens de células de carrapatos, após 24 horas de incubação. O material fluorescente no interior das células se apresentou de maneira pontual e espiroquetas intactas não puderam ser detectadas, sugerindo sua localização intracelular em fagossomo. Estes resultados indicam que diferenças na capacidade de resposta dos tecidos envolvidos na resposta imune celular podem ser determinantes na competência vetorial dos carrapatos. A marcação de Borrelia spp. com PKH67 pode ser utilizada para análise da associação com células de carrapatos utilizando citometria de fluxo, microscopia confocal e de imunofluorescência.