Avaliação da expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) e efeito do silenciamento das isoformas OsA2 e OsA7 de PM H+-ATPases na absorção de nitrogênio em arroz

Abstract

A disponibilidade de nitrogênio (N) nos solos é geralmente baixa, o que leva a necessidade do aporte frequente de fertilizantes e a busca por variedades mais eficientes no uso de N. Dentre os parâmetros favoráveis se inclue a maior expressão das bombas de prótons de membrana plasmática e de transportadores de nitrato de alta afinidade sob cultivos com baixo N. Neste trabalho se identificou o padrão de expressão das isoformas OsNRT1.1A, OsNRT1.1B e OsNRT1.1C, prováveis ortólogos do transportador de nitrato de dupla afinidade NRT1.1 de Arabidopsis (CHL1; NPF8.9) em resposta ao NO3- e NH4+, assim como se avaliou a importância dos genes das bombas de prótons OsA2 e OsA7 para a absorção de N. Para avaliar a expressão dos genes OsNRT1.1 (A, B e C) foram conduzidos dois experimentos: um com a variedade de arroz Nipponbare e o outro com as variedades IAC-47 (melhorada) e Piauí (local). O silenciamento dos genes osa2 e osa7 foi realizado usando a técnica do microRNA artificial (amiRNA) seguida de transformação genética do arroz. O experimento para avaliar a contribuição das duas isoformas de H+-ATPases de membrana plasmática (PM H+-ATPase) para a absorção de NO3- em baixas doses foi com as variedades IAC-47 e Piauí. Nas raízes as isoformas OsNRT1.1A e OsNRT1.1B foram as mais expressas, enquanto OsNRT1.1C apresentou baixa expressão. OsNRT1.1B demonstrou alta repressão com ressuprimento de 2,0 mM de N-NO3-, nas plantas cultivadas com NH4+ e sob deficiência de N, no entanto, OsNRT1.1B foi induzido pelo tratamento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Após a transformação do arroz com o amiRNA para silenciar OsA2 e OsA7, a análise de expressão por PCR em tempo real mostrou que entre as duas construções, para cada gene, somente uma promoveu o silenciamento do gene, sendo as linhagens com silenciamento multiplicadas em casa de vegetação. As linhagens de arroz mutantes silenciando os genes OsA2 (osa2.2, osa2.3, osa2.4), OsA7 (osa7.1, osa7.2, osa7.3) e plantas controle IRS (plantas transformadas com vetor IRS154 vazio) foram cultivadas com quatro tratamentos: sem N por três dias, suprimento constante com 0,2 mM de N-NO3-, ressuprimento com 0,2 mM de N-NO3- após três dias de privação de N e suprimento constante com 2,0 mM de N-NO3-. Os mutantes osa7 apresentaram menor crescimento vegetativo, enquanto os mutantes osa2 cresceram normalmente em comparação com o controle IRS. Ambos os mutantes apresentaram menor influxo de NO3- quando cultivados com 0,2 mM de N-NO3- constante comparados com o controle IRS, enquanto nos outros tratamentos não houve diferença no influxo de NO3-. A atividade das PM H+-ATPases foi menor nos mutantes osa7 e osa2 em relação ao controle IRS em todos os tratamentos usados. A atividade da V-H+-ATPase não apresentou mudança em ambos os mutantes (osa7 e osa2), enquanto a atividade da V-H+-PPase foi menor somente nos mutantes osa7 quando comparado ao controle IRS. Os mutantes osa2 apresentaram menor índice de Eficiência de Absorção de N, com menor acúmulo de N-total com 0,2 mM de N-NO3- constante. Os resultados obtidos demonstram que há uma contribuição diferenciada de isoformas específicas de PM H+-ATPases para o crescimento vegetativo em arroz e para a eficiência de absorção de NO3-.