Atividade proteolítica de bactérias psicrotróficas isoladas de leite cru e implicações nos testes de adição fraudulenta de soro de queijo.

Abstract

Fraude em leite por adição de soro é um problema recorrente no Brasil, enquanto a contaminação e deterioração do leite por bactérias psicrotróficas é um dos principais problemas enfrentados pela indústria de laticínios. Dentre estas bactérias, o gênero Pseudomonas tem sido destacado em diversos estudos microbiológicos como grupo predominante na microbiota do leite refrigerado. Mais recentemente, esta predominância tem sido confirmada através da aplicação de técnicas moleculares de identificação microbiana. Ainda, análises moleculares têm servido para levantar questões a respeito da precisão de algumas identificações fenotípicas realizadas anteriormente, e em relação ao papel de gêneros e espécies não detectados ou subestimados, e que podem ser encontrados como componentes principais da microbiota do leite refrigerado. Problemas relacionados à qualidade do leite e derivados devido à sua multiplicação e atividade enzimática são somados ao fato de que as suas proteases podem provocar resultados falso-positivos na detecção de fraude por adição de soro. Esta prática, comum em alguns países, inclusive o Brasil, é normalmente detectada através da análise do índice de CMP. Neste estudo, o total de 12 linhagens de bactérias psicrotróficas isoladas de leite e identificadas fenotipicamente em estudo anterior (ARCURI et al., 2008) foram reidentificadas usando métodos genotípicos baseados na análise da sequência (16S rRNA) que codifica a subunidade menor do DNA ribossomal. Esta técnica proporcionou identificação em nível de espécie para quatro linhagens recebidas como Acinetobacter spp. como sendo A. guillouiae (3) e A. johnsonii (1), além de identificar como P. rhodesiae uma linhagem recebida como P. fluorescens. Adicionalmente, três linhagens recebidas como P. putida foram reclassificadas como P. psychrophila e uma linhagem fenotipicamente identificada como Aeromonas hydrophila foi identificada como A. punctata. O crescimento dessas bactérias em temperatura de refrigeração foi avaliado através da inoculação no leite (ca 103 UFC mL-1) e incubação em diferentes tempos/temperaturas (refrigeração), em acordo com delineamento fatorial (22) com três repetições no ponto central. Após cada período, a produção de CMP foi avaliada por cromatografia líquida com filtração em gel (HPLC-FG) e os resultados de um subgrupo de amostras foram comparados com os obtidos por teste imunocromatográfico rápido e por cromatografia líquida com ionização em eletrospray acoplada a espectrometria de massas em modo tandem (HPLC-ESI-MS/MS), cuja sensibilidade torna possível identificar resultados falso-positivos. A produção de CMP avaliada por HPLC-FG foi maximizada pela condição 10°C/4d para todas as linhagens, exceto para acinetobacters. Duas linhagens de P. rhodesiae apresentaram os maiores níveis, seguido por uma linhagem A. hydrophila (P07). Modelos lineares foram construídos para crescimento bacteriano, no entanto, para a produção de CMP 66.6% das amostras apresentaram tendência a comportamento quadrático. A análise por HPLC-ESI-MS/MS mostrou que a percentagem de pseudo CMP na condição 10°C/4d foi superior a 50% em viii relação ao CMP verdadeiro em todas as amostras, exceto para a inoculada com A. punctata (P65). Apesar da temperatura (10°C) não ser permitida na legislação brasileira para armazenamento do leite, os dados demonstram o potencial dessas linhagens em gerar resultados falsos positivos (por HPLC-FG) para a adição fraudulenta de soro no leite.