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Tipo do documento: Tese
Title: Atividade proteolítica de bactérias psicrotróficas isoladas de leite cru e implicações nos testes de adição fraudulenta de soro de queijo.
Other Titles: Proteolytic activity of psychrotrophic bacteria isolated from raw milk and implications for detection of fraudulent whey addition
Authors: Oliveira, Gislene Bremer de
Orientador(a): Luchese, Rosa Helena
Primeiro coorientador: Mc Intosh, Douglas
Primeiro membro da banca: Oliveira, Marcone Augusto Leal de
Segundo membro da banca: Cortez, Marco Antonio Sloboda
Terceiro membro da banca: Martins, José Francisco Pereira
Quarto membro da banca: Oliveira, Valéria Moura de
Keywords: HPLC-GF;fraude;Pseudomonas;HPLC-GF;fraud;Pseudomonas
Área(s) do CNPq: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Idioma: por
Issue Date: 4-Jun-2013
Publisher: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Sigla da instituição: UFRRJ
Departamento: Instituto de Tecnologia
Programa: Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Citation: OLIVEIRA, Gislene Bremer de. Atividade proteolítica de bactérias psicrotróficas isoladas de leite cru e implicações nos testes de adição fraudulenta de soro de queijo. 2013. 121 f. Tese (Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica.
Abstract: Fraude em leite por adição de soro é um problema recorrente no Brasil, enquanto a contaminação e deterioração do leite por bactérias psicrotróficas é um dos principais problemas enfrentados pela indústria de laticínios. Dentre estas bactérias, o gênero Pseudomonas tem sido destacado em diversos estudos microbiológicos como grupo predominante na microbiota do leite refrigerado. Mais recentemente, esta predominância tem sido confirmada através da aplicação de técnicas moleculares de identificação microbiana. Ainda, análises moleculares têm servido para levantar questões a respeito da precisão de algumas identificações fenotípicas realizadas anteriormente, e em relação ao papel de gêneros e espécies não detectados ou subestimados, e que podem ser encontrados como componentes principais da microbiota do leite refrigerado. Problemas relacionados à qualidade do leite e derivados devido à sua multiplicação e atividade enzimática são somados ao fato de que as suas proteases podem provocar resultados falso-positivos na detecção de fraude por adição de soro. Esta prática, comum em alguns países, inclusive o Brasil, é normalmente detectada através da análise do índice de CMP. Neste estudo, o total de 12 linhagens de bactérias psicrotróficas isoladas de leite e identificadas fenotipicamente em estudo anterior (ARCURI et al., 2008) foram reidentificadas usando métodos genotípicos baseados na análise da sequência (16S rRNA) que codifica a subunidade menor do DNA ribossomal. Esta técnica proporcionou identificação em nível de espécie para quatro linhagens recebidas como Acinetobacter spp. como sendo A. guillouiae (3) e A. johnsonii (1), além de identificar como P. rhodesiae uma linhagem recebida como P. fluorescens. Adicionalmente, três linhagens recebidas como P. putida foram reclassificadas como P. psychrophila e uma linhagem fenotipicamente identificada como Aeromonas hydrophila foi identificada como A. punctata. O crescimento dessas bactérias em temperatura de refrigeração foi avaliado através da inoculação no leite (ca 103 UFC mL-1) e incubação em diferentes tempos/temperaturas (refrigeração), em acordo com delineamento fatorial (22) com três repetições no ponto central. Após cada período, a produção de CMP foi avaliada por cromatografia líquida com filtração em gel (HPLC-FG) e os resultados de um subgrupo de amostras foram comparados com os obtidos por teste imunocromatográfico rápido e por cromatografia líquida com ionização em eletrospray acoplada a espectrometria de massas em modo tandem (HPLC-ESI-MS/MS), cuja sensibilidade torna possível identificar resultados falso-positivos. A produção de CMP avaliada por HPLC-FG foi maximizada pela condição 10°C/4d para todas as linhagens, exceto para acinetobacters. Duas linhagens de P. rhodesiae apresentaram os maiores níveis, seguido por uma linhagem A. hydrophila (P07). Modelos lineares foram construídos para crescimento bacteriano, no entanto, para a produção de CMP 66.6% das amostras apresentaram tendência a comportamento quadrático. A análise por HPLC-ESI-MS/MS mostrou que a percentagem de pseudo CMP na condição 10°C/4d foi superior a 50% em viii relação ao CMP verdadeiro em todas as amostras, exceto para a inoculada com A. punctata (P65). Apesar da temperatura (10°C) não ser permitida na legislação brasileira para armazenamento do leite, os dados demonstram o potencial dessas linhagens em gerar resultados falsos positivos (por HPLC-FG) para a adição fraudulenta de soro no leite.
Abstract: Fraud in milk by whey addition is a recurring issue in Brazil, while the contamination and spoilage of milk by psychrotrophic bacteria is one of the main problems faced by the dairy industry. Among these bacteria, the genus Pseudomonas has been highlighted in numerous microbiological studies as the predominant group in the microbiota of cold stored milk. Recently, this predominance has been confirmed via the application of molecular techniques for microbial identification. Yet, molecular analyses have served to raise questions regarding the accuracy of some earlier phenotypic identifications, and concerning the role of previously undetected and/or underestimated genera/species which may be found as major components of the microbiota of cold stored milk. Problems related to the quality of milk and dairy products due to the growth and enzymatic activities of psychrotrophs are compounded by the fact that the production of proteases by the bacteria may cause false-positive results in tests employed for detection of milk fraud by whey addition. This is a common practice in some countries, including Brazil, and usually detected by analyzing the CMP index. In the current study, a total of 12 strains of psychrotrophic bacteria isolated from milk and phenotypically identified in a previous study (ARCURI et al., 2008) were reidentified using genotypic methods based upon analysis of the sequence (16S rDNA) encoding the small subunit of ribossomal RNA. This approach provided identification to the species level for four strains received as Acinetobacter spp. as A. guillouiae (3) and A. johnsonii (1), and identified as Pseudomonas rhodesiae an isolate received as P. fluorescens. In addition, three isolates received as P. putida were reclassified as P. psychrophila and an isolate phenotypically identified as Aeromonas hydrophila was identified as A. punctata. The growth of these bacteria at refrigeration temperatures was examined by inoculation of milk (ca 103 CFU mL-1) with incubation at different times/temperatures (refrigeration), in accordance with a factorial design (22) with three repetitions at the central point. After each incubation period, the production of CMP was assessed by high performance liquid chromatography (HPLC-GF) and the results of a subgroup of samples were compared with those obtained by immunoassay and liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry in tandem mode (HPLC-ESI-MS/MS), which sensitivity makes possible the identification of false-positive results. The production of CMP, as assessed by HPLC-GF was maximal at 10°C/4d for all strains, with the exception of the acinetobacters. Two strains of P. rhodesiae showed the highest levels, followed by a strain of A. hydrophila (P07). Linear models were constructed for bacterial growth; however, for CMP production 66.6% of the samples showed a quadratic trend. The HPLC-ESI-MS/MS analysis showed that the percentage of pseudo CMP in some samples (condition 10°C/4d) was in excess of 50% compared to true CMP for all samples, except for the milk inoculated with an isolate identified as A. punctata (P65). Despite the fact that the temperature (10°C) is not permitted under Brazilian legislation for x milk storage, the data demonstrated the potential of these strains to generate false-positive results (via HPLC-GF) for the fraudulent addition of whey.
URI: https://rima.ufrrj.br/jspui/handle/20.500.14407/9259
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