Monitoramento da dispersão de cepas de Escherichia coli em ambiente de produção leiteira

Abstract

A atividade leiteira tem sido de grande importância para economia em todo o mundo e, por esse motivo, cada vez mais os produtores têm buscado melhorias na qualidade do leite, focando no controle de enfermidades que acometem o rebanho, em especial da mastite bovina. A mastite ambiental pode gerar grandes impactos na bovinocultura leiteira, sendo esta comumente ocasionada por microrganismos como Escherichia coli. Esta espécie bacteriana possui heterogeneidade genética e população caracterizada por cepas geneticamente diversificadas, além da capacidade de persistir no ambiente de produção por tempo prolongado. Frente a esse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as relações clonais de E. coli em ambiente de produção leiteira através das técnicas de tipagem molecular Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) e Multilocus Sequence Typing (MLST), para isso 444 amostras distribuídas entre leite, fezes, água e cadeia produtiva oriundas de uma fazenda localizada no município de Barra do Piraí no Estado do Rio de Janeiro, Brasil, foram submetidas a testes bioquímicos e a técnica de MALDI-TOF MS para identificação bacteriana. Além disso, as amostras de água (poço, açude, bebedouro, torneira e riacho) foram submetidas ao teste do Número Mais Provável (NMP) para avaliação de coliforme totais e termotolerantes no qual apresentaram padrões de potabilidade superiores aos estipulados pelo Ministério da Saúde. De 183 enterobactérias identificadas, 152 (83%) foram confirmadas através de ambas as metodologias como E. coli. Destas, nove representantes tiveram o gene gyrB sequenciado para confirmação molecular da espécie apresentando até 99% de máxima identidade quando as sequências foram comparadas com as sequências do banco de dados NCBI. Posteriormente, todas as 152 cepas de E. coli foram submetidas fenotipicamente a produção de biofilme e detecção de genes de virulência, onde foi possível observar que 41,44% (63/152) de cepas foram produtoras de biofilme, sendo 37,5% (57/152) fraca produdoras, 1,31% (2/152) produtoras moderadas e 2,63% (4/152) fortes produtoras. Além disso, foi possível detectar 92, 1% (140/152) de cepas positivas para o gene fimH; 88,8% (135/152) para o gene csgA, 29,6% (45/152) para o gene flu (que são genes relacionados ao biofilme) e 13,1% (20/152) positivas para o gene eaeA; 7,2% (11/152) para o gene LT e 2,6% (4/152) para o gene stxI. Nenhuma cepa foi positiva para os genes stxII, ST, ial e eagg. A partir destes resultados, 18 perfis foram estabelecidos com o propósito de selecionar 30 cepas que foram processadas no laboratório de genética da Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina, através da técnica PFGE, onde foi possível observar uma elevada variabilidade genética. As cepas que apresentaram de 95% a 100% de similaridade (n=10) foram sequenciadas, a fim de estabelecer uma relação clonal entre elas através da técnica de MLST, que gerou oito tipos diferentes de ST, sendo o ST164 e o ST1308 os que estabeleceram possíveis relações clonais entre cepas. Além disso, foi observado um novo tipo de sequência (ST) que deverá ser submetido a um sequenciamento de nova geração, e então ser enviado ao curador do MLST para que seja gerado um novo número de ST e depositado no banco de dados do esquema. Ao realizar buscas tanto no banco de dados quanto na literatura, não foram encontrados no Brasil relatos sobre os STs (ST5, ST164, ST165 e ST1308) estudados provenientes de cepas de E. coli bovinas, levando ao entendimento de que este trabalho é o primeiro relato no país.