Estudo da atividade enzimática e patogênica de isolados brasileiros de Metarhizium anisopliae s.l. visando o uso no controle biológico de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Abstract

O fungo Metarhizium anisopliae sensu lato é um dos micro-organismos mais promissores a ser utilizado no controle de carrapato, e por isso, vem sendo estudado em todo o mundo, demonstrando potencial acaricida, principalmente em testes in vitro. Entretanto, tem sido observada variação na virulência entre diferentes isolados deste fungo. Nessa perspectiva, o presente estudo teve como objetivos verificar a ação patogênica em suspensões aquosas e em diferentes formulações oleosas e também analisar a ação enzimática de isolados brasileiros de M. anisopliae s.l. com a finalidade de selecionar isolados mais virulentos para utilização em futuros programas de biocontrole de carrapatos. Além disso, pesquisar a presença de partículas virais de dsRNA e associar as atividades enzimáticas, inclusive da subtilisina Pr 1 secretadas pelos isolados de M. anisopliae s.l. com os percentuais de controle, visando estabeler marcadores moleculares de virulência específicos para o carrapato R. microplus. Para tanto, cinco linhagens de M. anisopliae s.l. isolados de diferentes estados brasileiros foram analisadas. Primeiramente foi realizado um bioensaio para testar a virulência destes isolados sobre fêmeas alimentadas de R. microplus. Concomitantemente foram realizados ensaios enzimáticos para quantificar as atividades de lipases, proteases e quitinases secretadas pelos diferentes isolados de M. anisopliae s.l. cultivados em meio líquido contendo cutícula de carrapato e estearato de colesteril, através da utilização de substratos cromogênicos e fluorescentes. Para a pesquisa de micovírus, foi realizada a extração do ácido nucléico total que foi submetido à digestão por uma endonuclease S1 e uma RNAse A e posteriormente visualizado em gel de agarose. Além desses ensaios, foi realizado um bioensaio utilizando diferentes formulações oleosas, uma a base de óleo vegetal e outra com óleo mineral, ambas a 10%. Neste experimento, fêmeas de R. microplus completamente alimentadas foram imersas por três minutos nos respectivos tratamentos, a eficácia dos tratamentos foi avaliada através de alterações provocadas nos parâmetros reprodutivos destas fêmeas. O estudo demonstrou que há variação na virulência entre os isolados brasileiros de M. anisopliae s.l. para fêmeas alimentadas de R. microplus, além disso, ficou evidenciado que os isolados que apresentaram os maiores percentuais de controle foram também os que tiveram as maiores atividade lipolítica, proteolítica e quitinolítica. Pelo fato da enzima Pr 1 ser sabidamente envolvida no processo de infecção de M. anisopliae s.l., os resultados aqui encontrados demonstraram a possibilidade de usar a atividade desta enzima como um potencial marcador molecular para R. microplus, visto que os isolados que apresentaram maior atividade de Pr 1 foram os mais virulentos para esta espécie de carrapato. Entretanto, não foi evidenciada nenhuma relação entre a virulência com a infecção por partículas de dsRNA, sendo que dos cinco isolados testados, somente um não estava infectado. A partir do bioensaio utilizando formulações oleosas, ficou evidenciada que as formulações contendo óleo mineral foram mais eficientes do que as que continham óleo vegetal, proporciondo os melhores percentuais de controle. Além disso, pode-se concluir que os isolados CG 148 e CG 629 quando em formulação de óleo mineral apresentam alto potencial de controle para fêmeas ingurgitadas de R. microplus