Caracterização molecular de Ehrlichia canis (Donatien e Lestoquard, 1935) em cães do estado do Rio de Janeiro

Abstract

Os objetivos do presente estudo foram de caracterizar molecularmente Ehrlichia canis, utilizando os genes de glicoproteínas de membrana (gp19, gp36, p28) e o gene Fator de Alongamento termo instável (tuf) para caracterização gênica juntamente com o gene 16S rDNA das amostras de sangue de cães naturalmente infectados, bem como avaliar a distribuição de E. canis e fatores associados em cães oriundos das mesorregiões do estado do Rio de Janeiro. Foram testadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) com alvo em um fragmento de 93 pares de base (pb) do gene 16S rDNA para a detecção de E. canis. Para realização da caracterização molecular, as amostras positivas nesta primeira análise foram testadas por PCRs convencionais para os genes gp19 (414 pb), gp36 (814 pb) e p28 (840 pb). Uma amostra de cada mesorregião amplificada para os genes gp19, gp36 e p28 foram purificadas e sequenciadas, utilizando-se o método Sanger. Antes de avaliar a diversidade genética de E. canis, as amostras foram submetidas à detecção molecular por 16S rDNA-qPCR. Foram coletadas 267 amostras de sangue de cães do estado do Rio de Janeiro. Entre as amostras analisadas, 42,3% (n = 113/267) foram positivas para qPCR para o gene 16S rDNA de E. canis. O valor médio de Cq observado nas amostras positivas foi de 34,1 ± 5,1, variando entre 18 e 40 ciclos. O limite de detecção do qPCR foi de 10 cópias do plasmídeo por μL contendo um gene 16S rDNA de E. canis. O coeficiente de determinação das sete diluições testadas na curva padrão foi de 99,9% e eficiência de 95,7%. Ao realizar PCR para os genes gp19 e gp36, 100% (n=113/113) e 5,3% (n=6/113) das amostras foram positivas, respectivamente. As seis amostras positivas para PCR para o gene 16S rDNA também amplificaram o gene p28. Apenas uma amostra PCR positiva para os três genes (gp19, gp36 e p28) em cada uma das seis mesorregiões foi selecionada e submetida à análise de sequências de aminoácidos e nucleotídeos. A freqüência em cada mesorregião para os 113 animais positivos para E. canis, pelo gene 16S rDNA, foi de 59,29% (n=67/113) para mesorregião Metropolitana, 13,27% (n =15/113) para região Sul Fluminense, 15,04% (n=17/113) para mesorregião Norte Fluminense, 5,3% (n= 6/113) para mesorregião Centro Fluminense, 4,42% (n=5/113) na mesorregião Noroeste Fluminense e 2,65% (n= 3/113) na Baixada Litorânea. A caracterização baseada no gene gp19 demonstrou que este gene é altamente conservado e as amostras apresentaram 100% de similaridade com as sequências brasileiros e mundiais disponíveis no GenBank. Utilizando o gene gp36, foi possível observar que há pontos polimórficos entre as sequências. Na análise de agrupamentos nota-se a formação de 3 clados, as sequências do presente estudo alocaram-se no genogrupo dos Estados Unidos, sugerindo similaridade genética entre as sequências brasileiras e norte-americanas. Na análise de proteínas, todas as amostras apresentaram sequências repetidas (“Tandem Repeat Sequence”), com 11 repetições. Foram observados sete sítios de aminoácidos de alta entropia, com variações de Hx: 0,5 a 0,67 gerando uma média de entropia de 0,6 detectados ao longo de TRP36, o que sugere um alto grau de polimorfismo. A razão das mutações não-silenciosas sobre as silenciosas, utilizando ambos genes mostrou diferenças genéticas significativas (p<0,05) entre as sequências do presente estudo demonstrando que há pressão de seleção positiva em ambos os genes analisados. As sequências E. canis-BaixLit e E. canis-Met apresentaram identidade de 100% e 99% para os genes tuf e 16S rDNA quando comparados a sequência de referência Jake- EUA (CP000107) e Oklahoma- EUA (M73221), respectivamente. Tanto a análise do gene 16S rDNA como no gene tuf, foi observado a formação de dois Clados bem definidos, sendo o Clado A formado por amostras de E. canis e outras espécies do gênero Ehrlichia e o Clado B com outros organismos do gênero Anaplasma, com distância de 0,09 para o gene 16S rDNA e 0,39 para o gene tuf, demonstrando a importância do gene 16S rDNA na avaliação entre gêneros distintos. Foi observado que, a partir do diagnóstico citológico e do diagnóstico molecular (gene gp19) realizado no total de 267 amostras, 54,68% (n=146/267) apresentaram inclusões basofílicas sugestivas de parasitismo, e 43,80% (n=117/267) ocorreram amplificação de 414 pb do gene gp19, demonstrando discordância entre as técnicas (p=0,0004). Dentre os 117 animais em que foi detectado o DNA de E. canis, sendo o maior percentual (60,68%; n=71/117) nos cães da Mesorregião Metropolitana. A raça e sexo dos cães não apresentaram associação (p>0,05) com a positividade de Ehrlichia canis nas sequências analisadas. A investigação de diferenças gênicas nos isolados de E. canis torna-se útil para o entendimento e conhecimento da relação parasito-hospedeiro; além disso determinar a distribuição desta bactéria nos municípios avaliados torna-se vantajoso para a atualização da cadeia epidemiológica da erliquiose canina.