Esterilização química do meio de cultura para micropropagação de cana-de-açúcar [Saccharum spp.]

Abstract

A utilização de técnicas alternativas que possibilitem a esterilização dos meios de cultivo, aliada ao bom desenvolvimento dos explantes, é de fundamental importância para garantir a elevada produção de plantas micropropagadas em laboratórios comerciais, de forma economicamente viável. Objetivando substituir o método de esterilização por autoclavagem pela esterilização química de meios de cultura, de vidrarias e de utensílios, testaram-se produtos e metodologias potenciais para viabilizar um protocolo de esterilização química que permita a produção em larga escala de mudas micropropagadas de cana-de-açúcar, oriundas de cultura de ápices caulinares, com reduzido custo de produção. As técnicas de esterilização química consistiram em preparar meio MS esterilizados com clor•in®, hipocloritos de sódio (NaClO) e de cálcio (Ca(ClO)2), às seguintes concentrações: 0,0003, 0,0006 e 0,0009% de cloro ativo total. Os experimentos contaram ainda com dois controles – autoclave e sem esterilização. Foram utilizadas dez repetições (frascos) por tratamento, contendo 40mL de meio de cultura do respectivo tratamento, onde os explantes foram inoculados. Para testar os hipocloritos, utilizou-se a cultivar RB99395, em seu 4º subcultivo; já para o clor•in®, utilizouse a RB952890 (3º subcultivo). Anteriormente à realização de qualquer trabalho, toda a área do laboratório foi higienizada com NaClO a 2%. A contaminação foi monitorada ao longo dos 20 dias de duração de cada experimento, e passado esse tempo, foram tomados os seguintes dados das repetições que não apresentaram contaminação: altura, número de perfilhos e biomassas fresca e seca. Para a esterilização com hipocloritos, dentre os tratamentos contaminados (sem esterilização, 0,0003, 0,0006 e 0,0009% Ca(ClO)2), houve predominância de contaminantes de origem fúngica. No mesmo experimento, o NaClO apresentou potencial para viabilizar um novo protocolo de esterilização química no cultivo in vitro de cana-deaçúcar cultivar RB99395, já a partir de 0,0003% de c. a. total, pois os explantes inoculados nestes tratamentos apresentaram maior desenvolvimento quando comparadas ao controle autoclavado. Quando se testou o clor•in®, toda a contaminação observada foi de origem fúngica, sendo que apenas o controle sem esterilização apresentou contaminação em todas as amostras. Após as análises de desenvolvimento dos explantes obtidos através desta metodologia de esterilização, foi possível sugerir o uso deste produto como alternativa para o controle da contaminação no cultivo in vitro de cana-de-açúcar cultivar RB952890, visto que apresentou o mesmo nível de controle das amostras autoclavadas. Contudo, observou-se baixo desenvolvimento das plântulas inoculadas em meio MS esterilizado com este produto, nas três concentrações de c. a. total, sugerindo a possibilidade de haver influência fitotóxica de algum componente do produto. Apesar de os produtos mostrarem potencial para o desenvolvimento de novos protocolos de esterilização, há a necessidade de efetuar novos ensaios, não apenas para o ajuste das metodologias, como também para oferecer maior respaldo experimental para o desenvolvimento de um novo – e definitivo – protocolo de esterilização, substituindo a autoclavagem pela adição de produtos químicos ao meio nutritivo, reduzindo, assim, o custo das plântulas de cana-de-açúcar produzidas em laboratórios comerciais por técnicas de cultura de tecidos in vitro.