Padronização de um protocolo de extração de DNA genômico armazenado em cartões FTA® e diversidade genética de parasitos do gênero haemoproteus em aves selvagens da mata atlântica altimontana

Abstract

A Mata Atlântica é um dos biomas mais ricos em biodiversidade do mundo e abriga uma variedade impressionante de aves silvestres. Os parasitos pertencentes ao gênero Haemoproteus são classificados na família Haemoproteidae e têm como vetores insetos hematófagos das famílias Ceratopogonidae e Hippoboscidae. O objetivo deste estudo foi avaliar a diversidade genética de parasitos do gênero Haemoproteus no bioma Mata Atlântica, nos Parques Nacionais do Caparaó (MG), de Itatiaia e da Serra dos Órgãos (RJ), entre 700 e 2500 metros de altitude. Dentre as 586 aves amostradas, 94 foram positivas para Plasmodium/Haemoproteus, sendo obtida uma prevalência geral de 16,04% (n=94/586). Na análise filogenética as sequências obtidas (38) neste estudo agruparam-se em 6 clados bem suportados. O clado A foi composto por 10 amostras que se agruparam em clado exclusivo, tendo como grupo irmão Haemoproteus erythrogravidus. No clado B, quatro amostras se agruparam no grupo de Haemoproteus erythrogravidus. No clado C, quatro amostras formaram um grupo exclusivo, tendo como grupo irmão Haemoproteus zosteropis. Um total de 13 amostras se agruparam no clado de Haemoproteus nucleocentralis (clado D), 5 amostras no clado de Haemoproteus paraortalidum (clado E). As linhagens agrupadas no clado B só foram encontradas em Zonotrichia capensis. O clado C foi encontrado somente a 1500 metros de altitude. Com relação aos locais amostrados, H. erythrogravidus só foi encontrado no PN do Caparaó. E não houve ocorrência de Haemoproteus paraortalidum no PN da Serra dos Órgãos. Uma prevalência e diversidade genética relativamente alta em aves silvestres foi observada na região estudada. Através dos resultados obtidos neste estudo, enriquecemos o conhecimento sobre a diversidade global de parasitos do gênero Haemoproteus em aves endêmicas de diferentes espécies que ocorrem em áreas altimontanas da Mata Atlântica do Brasil. A seleção de um método de extração de DNA ideal deve levar em conta fatores como sensibilidade, consistência, rapidez e facilidade de execução. A literatura carece de evidências suficientes para apoiar a escolha de um método específico para extrair DNA de amostras de sangue total de aves. O objetivo deste trabalho foi padronizar um método de extração de DNA genômico a partir de sangue de ave selvagem coletado em FTA® Card. Foram testados 5 protocolos, entre eles: o Kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen), Salting Out, Hotshot e Fenol-Clorofórmio. Foi realizada a quantificação por espectrofotometria e fluorimetria, análise da pureza por espectrofotometria, teste de inibição por qPCR e integridade pela eletroforese em gel de agarose. As amostras extraídas através do protocolo do Kit Comercial “PureLink Genomic DNA Mini” apresentaram características visivelmente melhores quanto aos parâmetros avaliados comparada com as demais, obtendo então melhor resultado e maior eficiência. No teste de inibição houve um destaque para o kit da Invitrogen e para o método de Salting out que apresentam média de Cq mais baixas (p-valor 0,0568), contudo o kit apresentou valor mais baixo de desvio padrão. Este estudo fornece base científica para a extração de DNA genômico de alta qualidade a partir de quantidades pequenas de sangue, quando as amostras são armazenadas em cartões FTA®. Isso é particularmente benéfico para a pesquisa com aves, dada a grande variação de tamanhos e pesos entre as espécies. Conclui-se que a padronização de protocolos desempenha um papel fundamental na biologia molecular, uma vez que a extração eficiente de material genético é essencial para o sucesso das análises subsequentes.