Diagnóstico histopatológico, imuno-histoquímico e molecular da paratuberculose subclínica na Região Sul do Estado do Rio de Janeiro. 2013

Abstract

A dificuldade no diagnóstico da paratuberculose na fase assintomática está relacionada principalmente à resposta imune do hospedeiro frente aos diversos estágios da enfermidade; a maioria dos animais infectados por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) não apresenta e não apresentará sinais clínicos característicos da enfermidade ao longo de sua vida e pode eliminar, intermitentemente, o agente infeccioso no ambiente, através das fezes, mantendo a infecção no rebanho. Atualmente, os testes laboratoriais disponíveis para diagnóstico subclínico da paratuberculose apresentam baixa eficiência, o que limita o diagnóstico precoce da enfermidade e contribui para a ineficiência das medidas de controle da infecção no rebanho. O desenvolvimento de técnicas confiáveis e específicas para a detecção “post-mortem” da paratuberculose possibilita o diagnóstico antes do aparecimento dos sinais clínicos, e pode auxiliar na elaboração de novos testes para detecção “in vivo” da infecção. No Brasil, a paratuberculose já foi descrita em diversas espécies de ruminantes e em vários estados, no entanto, não há programas sanitários oficiais para o controle da enfermidade. Um dos objetivos deste trabalho foi detectar a infecção pré-clínica da paratuberculose em bovinos oriundos de rebanho positivo para paratuberculose por metodologias de diagnóstico anátomopatológico. Foram realizados estudos histopatológico, histoquímico e imuno-histoquímico de intestino delgado e linfonodos mesentéricos coletados no frigorífico local. À histopatologia, observaram-se lesões compatíveis com paratuberculose em animais assintomáticos; bacilos álcool-ácido resistentes não foram visualizados e a imuno-histoquímica mostrou marcação positiva em alguns fragmentos analisados. A partir dos resultados, podemos afirmar que o teste de imuno-histoquímica pode ser uma importante ferramenta para detecção de Map, especialmente em tecidos com lesões tuberculoide ou “paucibacillary”, enriquecendo os métodos convencionais de diagnóstico histopatológico para confirmação da infecção. Além disso, em situações onde não há disponibilidade de material para cultivo bacteriano pode-se utilizar desta metodologia para conclusão do diagnóstico. Na segunda parte do trabalho, foi realizado um estudo comparativo de duas soluções fixadoras de tecido, uma contendo formol, substância tradicionalmente utilizada em laboratórios de patologia e a outra composta por sais de zinco. O intuito do estudo foi avaliar a manutenção da histomorfologia, a capacidade de detecção de bacilos álcool-ácido resistentes e antígenos de Mycobacterium spp. por imunohistoquímica e amplificação dos fragmentos de DNA bovino e de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis por PCR GAPDH, IS900 e F57, em fragmentos de íleo e linfonodo mesentérico fixados, de bovino com paratuberculose clínica. Avaliaram-se, também, possíveis alterações causadas em diferentes períodos de tempo em que os fragmentos foram mantidos na solução fixadora. Verificou-se notável manutenção da arquitetura do tecido em fragmentos fixados em solução de zinco, com qualidade da imagem histológica similar aos tecidos fixados em formol; os resultados obtidos pela coloração de Ziehl-Neelsen e imunohistoquímica foram semelhantes nos dois fixadores. Já a PCR mostrou amplificação apenas nas amostras fixadas em zinco, o que demonstra que este fixador pode ser uma ferramenta importante para manutenção de ácidos nucleicos e macromoléculas para estudos genéticos e proteômicos.